趙文杰，陳麗紅

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門中醫(yī)院皮膚科，廈門361009）

復(fù)方青黛膏對(duì)尋常型銀屑病皮損內(nèi) VEGF的影響

趙文杰，陳麗紅

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門中醫(yī)院皮膚科，廈門361009）

目的 以銀屑病皮損內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）為指標(biāo)，探討復(fù)方青黛膏對(duì)銀屑病的治療機(jī)制。方法 60例尋常型銀屑病患者隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、他扎羅汀組、青黛膏組，療程4周。免疫組化檢測(cè)復(fù)方青黛膏治療前后皮損內(nèi)的VEGF陽性染色，并以video pro 32彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)定其灰度值。Realtime-PCR法檢測(cè)治療前后mRNA的表達(dá)，并與他扎羅汀對(duì)照及空白組比較。結(jié)果 復(fù)方青黛膏組皮損內(nèi)VEGF蛋白灰度值低于空白組及他扎羅汀組（P＜0.05），其VEGF mRNA表達(dá)水平較其他組低（P＜0.05）。結(jié)論 復(fù)方青黛膏可降低皮損內(nèi)VEGF的表達(dá)，通過抑制局部微血管增生治療尋常型銀屑病。

復(fù)方青黛膏；尋常型銀屑病；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子

新生血管學(xué)說在銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究中越來越被重視。銀屑病最先發(fā)生的病理改變是血管的分布和形成的改變，銀屑病的復(fù)發(fā)與皮損內(nèi)真皮乳頭的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的過度表達(dá)有關(guān)，其皮損處真皮乳頭微血管擴(kuò)張迂曲、通透性增高、微血管數(shù)量增多，并與VEGF的過高表達(dá)直接相關(guān)［1-2］。新生血管學(xué)說為臨床上治療銀屑病提供了重要線索，他扎羅汀治療銀屑病的機(jī)制之一可能在于減少銀屑病病人角質(zhì)形成細(xì)胞VEGF的表達(dá)，從而改善銀屑病皮損的血管擴(kuò)張、增生等病理改變，進(jìn)而減輕炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥反應(yīng)［3-4］。筆者發(fā)現(xiàn)外用復(fù)方青黛膏可有效地減輕患者皮損紅斑，肥厚及點(diǎn)狀出血等現(xiàn)象，故推測(cè)，這種現(xiàn)象與其抑制銀屑病血管新生有關(guān)。含青黛制劑的藥物治療銀屑病在我國已廣泛的應(yīng)用，但治療機(jī)制不明，內(nèi)服青黛引起消化道出血等不良反應(yīng)明顯 ，臨床應(yīng)用受到了限制。筆者基于銀屑病新生血管學(xué)說，探討外用復(fù)方青黛膏治療銀屑病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例為我科門診就診的尋常型銀屑病患者，確診納入試驗(yàn)后隨機(jī)分為3組：不用藥物治療的空白組，他扎羅汀治療組，復(fù)方青黛膏治療組。復(fù)方青黛膏組成：青黛粉50 g，黃柏粉20 g，滑石粉20 g，爐甘石粉20 g。以凡士林2 000 mL為基質(zhì)，100℃熔解后加入藥物，調(diào)均，冷卻后分裝，每30 g為1個(gè)包裝單位。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 我科門診病人，經(jīng)臨床及病理診斷確診為尋常型銀屑?。ㄟM(jìn)展期），中醫(yī)辨證屬風(fēng)熱血燥者，年齡＞16歲，近2個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)服用維A酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物，2周內(nèi)未使用任何外用藥物。中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參考《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》［5］風(fēng)熱血燥證：皮損鮮紅，皮疹不斷出現(xiàn)，紅斑增多，刮去鱗屑可見發(fā)亮薄膜，點(diǎn)狀出血。伴心煩口渴，大便干，尿黃。舌質(zhì)紅，舌苔黃或膩，脈弦滑或數(shù)。

1.3 治療方法 根據(jù)皮損面積，從小劑量開始隨病人耐受情況逐漸加量涂抹于皮損上，每日早晚各1次，每次擦涂不能大于皮膚總面積的20%，治療期間不得應(yīng)用非試驗(yàn)設(shè)計(jì)的其他藥物，試驗(yàn)共進(jìn)行4周，療程前后手術(shù)取病人同一區(qū)域內(nèi)典型皮損。所選擇的皮損在1%利多卡因局部麻醉下手術(shù)切除，切除后的皮損塊立即速凍在液氮中，應(yīng)用于免疫組化的皮損塊立即進(jìn)行石蠟包埋。

1.4 觀察指標(biāo) 1）免疫組化檢測(cè)皮損組織中VEGF含量。采取免疫組化二步法，試劑盒購于武漢博士德生物制品有限公司。操作參照試劑盒。VEGF表達(dá)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，在video pro 32彩色圖像分析系統(tǒng)下每張切片選取5個(gè)具有代表性的視野，在高倍鏡（×200）下進(jìn)行測(cè)試，測(cè)出測(cè)試區(qū)域的灰度值 ，以平均值作為該標(biāo)本的陽性系數(shù)。2）Real time PCR（SYBR Green I）檢測(cè)皮損內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)。RNA的提?。盒迈r組織加入1 000 μL TRIzol試劑（TaKaRa，Japan），電動(dòng)勻漿器充分勻漿后（5 min 1次，冰上孵育5 min，重復(fù)3次），室溫孵育15 min使組織細(xì)胞充分裂解。將處理液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中。加入0.2 mL氯仿劇烈震蕩30 s，室溫孵育15 min。4℃，12 000 rpm／min，離心15 min。轉(zhuǎn)移上層水相至另一離心管，加入0.5 mL異丙醇，混勻后室溫放置10 min。4℃，12 000 rpm／min，離心10 min。棄上清，加入1 mL DEPC處理75%乙醇。4℃，7 500 rpm／min，離心5 min。棄上清，室溫干燥10 min，加入20 μL DEPC處理ddH2O，收集管中的溶液即為RNA溶液。使用DU-730紫外／可見分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和總量后于-80℃保存?zhèn)溆?。cDNA合成根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA分別以0.5～1 μg的總RNA為模板合成cDNA，采用TaKaRa公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，采用TaKaRa公司提供SYBR ExScriptTM RT-PCR試劑盒，在ABI PRISM7000 Real-Time PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增儀自動(dòng)獲得各基因擴(kuò)增的原始Ct值，對(duì)比內(nèi)參基因得到△Ct值，通過-△△Ct的計(jì)算方法得到各組的-△△Ct值，根據(jù)模板濃度制定標(biāo)準(zhǔn)，曲線，測(cè)定擴(kuò)增效率E，各組的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的相對(duì)水平表示為E-△△Ct。PCR引物設(shè)計(jì)：參考文獻(xiàn)資料獲取引物序列，由廣州英駿生物工程有限公司合成。引物序列如下：VEGF-S：GGCCAACTAC AACTTCTTCC；VEGF-AS：CCATCATGGATTCGAG AAAA；Beta-actin-s：TCA TCACCATTGGCAATGAG；Beta-actin-as：CACTGTGTTGGCGTACAGGT。反應(yīng)體系為20 μL，共40個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后用單因素方差分析 ，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組治療前后皮損中VEGF變化 見圖1、表1。

表1 各組治療前后皮損中VEGF變化（±s，n＝20）

表1 各組治療前后皮損中VEGF變化（±s，n＝20）

注：與空白組比較，＃P＜0.05；與他扎羅汀組比較，△P＜0.05

治療后空白組 182．5±14.3 172.3±16.1他扎羅汀組 187.3±13．5 58．7±4．7＃青黛膏組 179．4±14．9 21．4±3．0組 別 治療前?！?/p>

2.2 各組患者皮損內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá) 見圖2。

3 討論

銀屑病皮損的主要病理變化是角化不全，角化過度，炎癥細(xì)胞浸潤，血管異常增生。其中，微血管增生與銀屑病的發(fā)生、持續(xù)及復(fù)發(fā)有密切的關(guān)系［6］，血管內(nèi)皮生長因子VEGF在血管生成不同過程中發(fā)揮重要作用，其特異性的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管生成［7］。銀屑病患者皮損中VEGF呈陽性表達(dá)，正常人皮膚組織中基本無表達(dá)［8］。VEGF在銀屑病發(fā)病中發(fā)揮主要作用的觀點(diǎn)又進(jìn)一步被表皮特異性過度表達(dá)VEGF轉(zhuǎn)基因鼠所證實(shí)［9-10］。

圖1 免疫組化檢測(cè)各級(jí)VEGF，圖中深色為VEGF陽性染色

圖2 各組患者皮損內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)青黛可抑制與角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖，外用青黛膏制劑可直接抑制銀屑病患者皮損內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原（PNCA），青黛及其有效成分靛玉紅可對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化起調(diào)控作用［11］。青黛制劑作為我國長期廣泛使用的抗銀屑病藥物，在臨床上取得令人滿意的療效。1991年來陸續(xù)報(bào)道了復(fù)方青黛丸、升血小板膠囊等含青黛成分的口服藥物產(chǎn)生消化道出血、肝功能損害等較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)［12］，推測(cè)消化道出血可能與青黛促凝作用導(dǎo)致管腔內(nèi)纖維素性血栓形成，堵塞血管，從而引起腸道黏膜缺血壞死有關(guān)。至此，青黛的安全性受到了質(zhì)疑。而外用青黛相關(guān)成分卻未見不良反應(yīng)的報(bào)道。

在既往的研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)方青黛膏外用可明顯減輕皮損內(nèi)的點(diǎn)狀出血、紅斑及炎性反應(yīng)［13］，此次研究中筆者發(fā)現(xiàn)，復(fù)方青黛膏可顯著降低銀屑病皮損中VEGF的表達(dá)，抑制皮損內(nèi)微血管增生，進(jìn)而減輕皮損內(nèi)的增生、角化、點(diǎn)狀出血及炎性反應(yīng)。但青黛抑制VEGF表達(dá)的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。VEGF是最重要的血管新生的因素，但微血管增生還受到其他細(xì)胞因子的影響：如成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血管生成素（angiopoiet-in）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血小板衍生性生長因子（platelet derived growthfactor，PDGF）等，致炎因子及缺氧亦是血管新生的促成因素［14］。下一步將進(jìn)行外用青黛制劑對(duì)微血管增生抑制作用的系統(tǒng)研究，并改良劑型以增加藥物透皮性等。

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Natural indigo compound ointment on psoriasis vulgaris by detecting VEGF in lesions

ZHAO Wenjie，CHEN Lihong
（Department of Dermatology，Xiamen Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Xiamen 361009，China）

Objective To study the therapeutic mechanism of natural indigo compound ointment on psoriasis based on detecting vascular endothelial growth factor in lesions．Methods The 60 patients with psoriasis vulgaris are randomly divided into 3 groups：natural indigo compound ointment，tazarotene cream and control groups．The course of treatment is four weeks．The expression of VEGF in psoriatic patients'lesions is observed by immunohisto-chemical assay before and after treatment and the grey level of VEGF is analyzed by video pro 32 color image analysis system．The expression of VEGF mRNA（P＜0．05）in lesions is detected by real-time PCR before and after treatment．Results The grey level of VEGF and expression of VEGF mRNA in lesions of natural indigo compound ointment group are lower than that in the tazarotene cream and control groups（P＜0．05）．Conclusion Natural indigo compound ointment can suppress the expression of VEGF and inhibite hyperplasia in micro-vessel in the treatment of psoriasis vulgaris．

natural indigo compound ointment；psoriasis vulgaris；vascular endothelial growth factor

R275.9

A

2095-6258（2015）05-1046-03

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．060

2014-10-21）

廈門市科技計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（3502Z20104011）。

趙文杰（1972-），男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事皮膚免疫學(xué)研究。