張愛紅，林虹君，任勇濤

1.防化學(xué)院，北京 102205；2.空軍防化大隊，北京 102206

1971 年瑞典學(xué)者Engvall 和Perlmann[1]、荷蘭學(xué)者van Weerman 和Schuurs[2]分別報道了將免疫技術(shù)發(fā)展成為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。ELISA 是在免疫酶技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型免疫測定技術(shù)，通過多年來的不斷改進(jìn)，現(xiàn)已成為一種有效的生化分析方法，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域[3]。但隨著研究的不斷深入，人們對痕量，甚至超痕量樣本的測定越來越多，這對ELISA 的檢測限提出了新的、更高的要求。另外，ELISA 的影響因素較多，容易造成結(jié)果失真，時間和操作要求非常嚴(yán)格，對于陽性的區(qū)別比較模糊，有時候需要反復(fù)實驗等。這些因素的存在都大大限制了其應(yīng)用。

鑒于目前存在的局限性，我們在傳統(tǒng)ELISA 方法中引入了納米金粒子（Au nanoparticles，AuNPs）和氧化石墨烯（graphene oxide，GO）。由于這兩種材料都具有制備過程簡單、比表面積大、易與蛋白質(zhì)結(jié)合、能保持抗體生物活性等優(yōu)點，在生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[4-5]。本研究旨在通過抗體功能化的AuNPs 和GO 的引入，逐級放大檢測信號，以減低ELISA的檢測限，擴(kuò)大該方法的適用范圍和領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（GST）、GST-Ab1、HRP-Ab2（購自北京康為試劑公司）；聚二甲基氯化銨（PDDA，20%，Mr：200 000～350 000）、牛血清白蛋白（BSA）、1-乙基-3-（3-二甲基氨）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（購自Sigma-Aldrich 公司）；石墨（美國Alfa Aesar公司）；氯金酸（HAuCl4·4H2O，南京市威圣化工貿(mào)易有限公司）；檸檬酸鈉（上海創(chuàng)順化工有限公司）；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20（購自北京化學(xué)試劑公司）；實驗用水為二次蒸餾水。

Milli-Q 型密理博純水儀（≥18 MΩ，美國Millipore公司）；Tecnai G2 20型透射電鏡（FEI香港有限公司）；PHI 5000C ESCA 型X 線光電子能譜儀（美國RBD公司）；85-2數(shù)顯型恒溫攪拌器（國瑞試驗儀器廠）；SORVSLL 型LEGEND MICRO 17 centrifrige（Therno 公司）；Dimension V 型原子力顯微鏡（美國Veeco公司）。

1.2 AuNPs與AuNPs-GST-Ab1的制備

將1 mL 濃度為10 g/L 的氯金酸溶液加入100 mL雙蒸水中，加熱至沸騰，然后迅速加入2.5 mL濃度10 g/L 的檸檬酸鈉溶液，充分?jǐn)嚢?，保持沸騰15 min。這期間溶液顏色依次由灰變藍(lán)再變紫，最后為酒紅色。移去熱源，自然冷卻至室溫，即制得平均粒徑為16 nm 的金顆粒，4℃保存?zhèn)溆肹6]。納米金在制備過程中，要保證所用玻璃器皿的絕對清潔，首先將所用器皿用王水（濃HNO3∶濃HCl=1∶3）浸泡過夜，然后用雙蒸水沖洗3 次，烘干待用。在加入檸檬酸鈉后要充分?jǐn)嚢?，以免形成的納米金顆粒聚集。在納米金與抗體結(jié)合后，要用錫箔包裹避光保存，以避免該結(jié)合體見光解離，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

在制備AuNPs 的基礎(chǔ)上，將0.3 mg GST-Ab1加入pH6.0 的納米金溶液中，室溫下攪拌2 h；然后加入2 mL 濃度為10 g/L 的BSA 溶液，室溫封閉30 min；13 300 r/min 離心10 min，溶液分成上、下兩層，上層為沒有結(jié)合的抗體，下層為黑色、松軟的結(jié)合物；除去上清，用含10 g/L BSA 的PBS 緩沖液（pH7.2～7.4）將產(chǎn)物（AuNPs-GST-Ab1）洗滌并離心3 次，最后溶于PBS 中，置于4℃?zhèn)溆?，該產(chǎn)物能在一個月內(nèi)保持活性[7]。

1.3 GO和GO-Ab2的制備

圖1 AuNPs（A）和AuNPs-GST-Ab1（B）的透射電鏡圖

石墨烯，又稱單層石墨或二維石墨，是單原子厚度的二維碳原子晶體，被認(rèn)為是富勒烯、碳納米管和石墨的基本結(jié)構(gòu)單元。石墨烯因具有大的比表面積、突出的導(dǎo)熱性能和力學(xué)性能及非凡的電子傳遞性能等一系列優(yōu)異性質(zhì)，被業(yè)內(nèi)人士廣泛關(guān)注[8-11]。制備GO 的方法很多，而將石墨氧化成氧化石墨，再在超聲條件下得到單層的GO溶液，已成為GO制備的有效途徑[12]。具體步驟如下：首先將0.5 g石墨粉末和0.5 g硝酸鈉加入23 mL預(yù)冷的濃硫酸中，攪拌反應(yīng)10 min；然后緩慢加入4 g高錳酸鉀，35℃反應(yīng)1 h；再向反應(yīng)體系中緩慢加入40 mL 蒸餾水，95℃反應(yīng)1 h，加入100 mL 蒸餾水終止反應(yīng)；然后加入2 mL 濃度為30%的H2O2，室溫反應(yīng)2 h，將產(chǎn)物離心，并用1 L的HCl（5%）洗滌，隨后用4 L蒸餾水洗滌，離心并再次洗滌；將得到的產(chǎn)物于40℃真空干燥48 h，即為GO粉末，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

將50 mg NaOH 和ClCH2COONa 加入1 mL 濃度為1 mg/mL的GO溶液中，超聲波裂解1.5 h；將產(chǎn)物GO-COOH 用雙蒸水洗滌3 次，除去過量的堿；將400 mmol/L EDC 和200 mmol/L NHS 一起加入1 mL MES緩沖液（pH6.0）中反應(yīng)30 min；將混合物于13 300 r/min 離心5 min，除去上清，此過程重復(fù)3次；將得到的GO-Ab2 溶于含有10 g/L BSA 的1.0 mL PBS（pH7.4）中，置于4℃?zhèn)溆肹8]。

2 結(jié)果和討論

2.1 AuNPs與AuNPs-GST-Ab1的表征

圖1A為AuNPs 的透射電鏡圖，圖1B為AuNPs-GST-Ab1 的透射電鏡圖。可以看出，AuNPs 為黑色球狀物，粒徑為16 nm。AuNPs 與GST 的抗體結(jié)合后，形成包裹黑色AuNPs顆粒的絮狀物。

2.2 GO與GO-Ab2的表征

圖2A 為GO 的透射電鏡圖，圖2B 為GO-Ab2 的透射電鏡圖，上面的黑色斑點為結(jié)合在GO片上的抗體。為保證GO與二抗的結(jié)合率，又不破壞抗體的活性，在由石墨制備得到GO 后，要用去離子水透析GO-COOH懸浮液48 h以上，以除去所有離子，因為雜質(zhì)粒子的存在對GO 與抗體的結(jié)合會產(chǎn)生非常不利的影響；然后將GO、EDC、NHS 和MES 緩沖液混合，反應(yīng)30 min，此時加入的EDC要過量，因為EDC遇水迅速發(fā)生水解，量太少不能發(fā)揮縮合的作用。

圖2 GO（A）和GO-Ab2（B）的透射電鏡圖

2.3 ELISA應(yīng)用

將抗體功能化的納米金和GO 用于ELISA 試驗。首先將GST附著在固相載體上，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)；然后加GST-Ab1與37℃撫育2 h，使抗體和GST結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物；洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)；加入酶標(biāo)抗體（HRPAb2），37℃撫育1 h，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合；洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)；最后加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物；通過酶標(biāo)儀讀數(shù)，測知GST 的量。ELISA 方法的操作流程如圖3所示。

圖3 改進(jìn)的ELISA（B）與傳統(tǒng)方法（A）對比示意圖

在A 路線中，每一個GST 分子只能結(jié)合一個對應(yīng)的一抗，而每個一抗也只能結(jié)合一個二抗和HRP；而在改進(jìn)后的B 路線中，每個GST 分子與結(jié)合在納米金顆粒上的多個（假定為x個，則x＞1）一抗中的一個結(jié)合，而其余一抗又可以和GO 上的二抗結(jié)合，通過GO 的連接作用，每個二抗可以和多個（假定為y個，y＞1）HRP 形成結(jié)合體，通過納米金和GO 的2 次串聯(lián)放大作用，能夠?qū)⑤^小的GST信號逐級放大，提高了檢測的靈敏度。

圖4 改進(jìn)后（A）與改進(jìn)前（C）ELISA結(jié)果對比圖B、D為陽性對照

為了考察改進(jìn)后ELISA 方法的性能，用抗體功能化的納米金顆粒和GO 對GST 進(jìn)行檢測。在圖4中，A 和C 行對應(yīng)的GST 濃度和稀釋方法（依次1/3梯度稀釋）完全相同，其中A 行使用AuNPs-Ab1 和GO-Ab2-HRPs，C 行使用傳統(tǒng)的Ab1 和Ab2-HRP，其余實驗因素完全相同。結(jié)果表明，對抗體功能化修飾后，ELISA 的檢測限從1.62 μg/mL 降低至0.02 μg/mL，檢測能力擴(kuò)大了81 倍。所以，用納米金和GO功能化修飾后的抗體分別代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體，可以有效地降低檢測限。多次試驗結(jié)果表明該方法穩(wěn)定，重復(fù)性好，可對樣本中低濃度蛋白質(zhì)進(jìn)行靈敏檢測。

綜上，通過AuNPs 和GO 對抗體進(jìn)行功能化修飾，用于ELISA檢測的雙信號放大，提高了該方法的檢測靈敏度，降低了檢測限，提高了其對痕量樣本的檢測能力，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。而且該方法重復(fù)性好，操作簡便，具有很強(qiáng)的實用價值?？梢灶A(yù)見，改進(jìn)后的方法將會在蛋白質(zhì)檢測和診斷學(xué)研究中發(fā)揮應(yīng)有的作用。

[1]Engvall E,Perlmann P.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）Quantitative assay of immunoglobulin G[J].Immunochemistry,1971,8:871-874.

[2]van Weemen B K,Schuurs A H W M.Immunoassay using antigen-enzyme conjugates[J].FEBS Lett,1971,15(3):232-236.

[3]張雯迪,蘇萍,楊屹,等..生物素-親和素放大酶聯(lián)免疫吸附法測定氯胺酮[J].分析化學(xué),2010,38(1):117-120.

[4]Sai B,Yan Y M,Yang X Y,et al.Gold nanolabels for new enhanced chemiluminescence immunoassay of alpha-fetoprotein based on magnetic beads[J].Chem Eur J,2009,15:4704-4709.

[5]馬文石,周俊文,程順喜.石墨烯的制備與表征[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報,2010,24(4):719-722.

[6]Cao W,Chen L,Fu Y J,et al.A highly efficient and versatile microchip capillary electrophoresis method for DNA separation using gold nanoparticle as a tag[J].J Sep Sci,2011,34:939-946.

[7]Cui R J,Liu C,Shen J M,et al.Gold nanoparticle-colloidal carbon nanosphere hybrid material preparation,characterization,and application for an amplified electrochemical immunoassay[J].Adv Funct Mater,2008,18:2197-2204.

[8]Du D,Wang L M,Shao Y Y,et al.Functionalized graphene oxide as a nanocarrier in a multienzyme labeling amplifica-tion strategy for ultrasensitive electrochemical immunoassay of phosphorylated p53(S392)[J].Anal Chem,2011,83(3):746-752.

[9]Wang G F,Huang H,Zhang G,et al.Dual amplification strategy for the fabrication of highly sensitive interleukin-6 amperometric immunosensor based on poly-dopamine[J].Langmuir,2011,27(3):1224-1231.

[10]Silva K P D,Borge J C.The molecular chaperone Hsp70 family members function by a bidirectional heterotrophic allosteric mechanism[J].Protein Peptide Lett,2011,18:132-142.

[11]Zhang L M,Xia J G,Zhao Q H,et al.Functional graphene oxide as a nanocarrier for controlled loading and targeted delivery of mixed anticancer drugs[J].Small,2010,6(4):537-544.

[12]Shun M,Lu G H,Yu K H,et al.Specific protein detection using thermally reduced graphene oxide sheet decorated with gold nanoparticle-antibody conjugates[J].Adv Mater,2010,22:3521-3526.