免疫磁珠捕獲富集結合HPLC－Q－TOF/MS技術分析復雜水樣中的蓖麻毒素

梁龍輝，劉石磊，于惠蘭，高 川，周世坤

(防化研究院 國民核化生災害防護國家重點實驗室，北京 102205)

蓖麻毒素(Ricin)是從天然植物蓖麻的種子中提取的一種Ⅱ型核糖體失活蛋白，由1條具有酶催化活性的A鏈和1條具有半乳糖殘基結合位點的B鏈通過1個二硫鍵連接而成，分子量為62～64 kDa［1］。蓖麻毒素的A鏈稱為效應鏈，是一種蛋白酶，具有失活核糖體功能，通過作用于真核細胞核糖體60S亞單位的28 SrRNA，并水解A4324位點的腺嘌呤，導致抗RNA酶的活性不可逆喪失，從而抑制蛋白質合成導致細胞死亡;B鏈稱為靶向鏈，其表面含有兩個半乳糖結合位點，能與細胞膜上糖蛋白或糖脂結合，從而介導A鏈進入細胞發(fā)生毒性作用［2］。蓖麻毒素是自然界中毒性最高的植物毒素之一，其毒性約為有機磷神經(jīng)性毒劑VX的385倍，氰化物的6 000倍，成人吸入蓖麻毒素的半致死染毒劑量(LD50)為5～10 μg/kg，口服LD50為1～20 mg/kg［3］。蓖麻植物種植廣泛，蓖麻毒素易于制備和獲取，加之缺乏有效的解毒措施，所以長期以來蓖麻毒素受到世界各國的高度關注。在禁止化學武器公約中，蓖麻毒素是唯一被列入禁控化學品清單的蛋白類毒素。由于很多國家的單一小規(guī)模設施都具有蓖麻毒素的生產(chǎn)能力。蓖麻毒素還被用于一些暗殺行動及恐怖事件［4］中，如1978年的馬爾科夫殺人傘案件，2013年的白宮蓖麻毒素恐嚇信件等。因此，建立準確、靈敏、快速的蓖麻毒素檢測方法，在化武履約、公共安全等領域的需求非常迫切。

目前，最常用、最靈敏的蓖麻毒素分析方法是免疫分析法，如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法［5－7］、抗體生物傳感器法［8］等。免疫分析法雖靈敏度高、操作簡便，但當抗體與其它具有相似作用位點的蛋白發(fā)生非特異性結合時，易出現(xiàn)假陽性結果。例如同樣從蓖麻植物中提取出的蓖麻凝集素(RCA120，分子量120 kDa)，也由A，B兩條鏈組成，與蓖麻毒素A，B鏈的氨基酸序列同源性分別高達94%和84%［9］，但其毒性遠小于蓖麻毒素。另一種Ⅱ型核糖體失活蛋白相思子毒素(Abrin)，可從植物相思的種子中提取得到，與蓖麻毒素具有相似的結構與毒性作用機理。目前的免疫分析法很難準確區(qū)分這3種蛋白，不能滿足當前準確鑒定的需求。為實現(xiàn)蛋白、多肽等生物大分子的準確、靈敏鑒定，近年來，電噴霧電離(ESI)和基質輔助激光解析電離(MALDI)等軟電離技術得到了越來越多的關注和發(fā)展，形成了生物質譜技術，可通過對蛋白分子量的準確測定以及酶解后肽質量指紋譜(PMF)數(shù)據(jù)分析等手段分析鑒定大分子蛋白［10－11］。MALDI－ TOF/MS［12］，LC － ESI/MS［13－15］等質譜技術用于蓖麻毒素分析，盡管取得了快速、準確的分析鑒定結果，但這些方法大多針對天然提取蓖麻毒素純樣或生物樣品基質，很少有針對應用最廣泛的水樣基質所建立的分析方法。

本研究選擇生活自來水、海水和OPCW考試用水3種具有代表性的水樣基質，利用結合有蓖麻毒素抗體的免疫磁珠進行免疫捕獲樣品前處理，對基質中的蓖麻毒素進行富集和純化，結合高效液相色譜－四極桿/飛行時間質譜(HPLC－Q－TOF/MS)建立了復雜水樣基質中蓖麻毒素的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

6520高效液相色譜－四極桿飛行時間質譜系統(tǒng)，1200快速高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);Mass Hunter B.04數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Agilent公司);Eppendorf 5424高速離心機(德國Eppendorf公司);12道磁力架(美國Promega公司);500 μL 10 kD超濾管(美國Millipore公司)。

乙腈(色譜純，美國Honey Well公司);甲酸、三氟乙酸(TFA)(色譜純，美國Sigma Aldrich公司);天然蓖麻子(河北康德瑞琪公司);蓖麻毒素標準品由本實驗室從天然蓖麻子中提取純化制備［16］，于－20℃冷凍保存;蓖麻毒素單克隆抗體6A6、HRP－標記的ricin單克隆抗體7G7以及包被抗體6A6的免疫磁珠由中科院生物物理所制備［17］;N-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，華美生物技術有限公司);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(美國Arcos公司);牛血清白蛋白(BSA，北京欣經(jīng)科生物技術公司)。

OPCW考試水樣為國際禁化武組織(OPCW)第33次官方水平考試樣品，含有大量鹽類以及化武公約相關附表化合物;海水取自大連黃花港;自來水取自本單位生活區(qū)。

1.2 色譜－質譜條件

色譜條件:Agilent Proshell 300SB－C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫30℃;流動相A為0.1%的甲酸水溶液，B為乙腈(含0.1%甲酸);洗脫梯度:0～2 min，5%B，2～8 min，5%～70%B，8～16 min，70%B，16～18 min，70%～5%B，總分析時間18 min;流速0.25 mL/min;柱溫30℃;進樣量 2 μL。

質譜條件:離子源ESI，正離子模式;掃描范圍為m/z 150～2 400;掃描頻率1.3 spectra/s;毛細管電壓(Vcap)3.5 kV;霧化氣壓力35 psi;干燥氣溫度350℃;干燥氣流速8 L/min;碎裂電壓150 V;聚焦電壓(Skimmer)65 V;儀器在高分辨率(4 GHz)、高質量范圍下(＜m/z 3 200)操作;使用嘌呤(m/z 121.05)和六(1H，1H，3H-全氟丙氧基)磷氮(m/z 922.01)作為基準物質進行質量校準，質量誤差低于5 ppm。

1.3 ELISA法考察免疫磁珠捕獲方法的回收率

按照文獻［17］用ELISA法繪制免疫磁珠捕獲檢測蓖麻毒素的標準曲線，并考察方法的回收率與精密度。向每個離心管中加入1 mL抗體稀釋液(1%BSA)和10 μL連接蓖麻毒素抗體6A6的Fe3O4磁性納米顆粒。除1號管作為空白外，將濃度分別為2，5，10，25，50，100 μg/mL的蓖麻毒素加入各離心管中，37℃孵育30 min后，放入帶有磁鐵的離心管架中進行磁吸附，再用PBST(含0.1%Tween－20的20 mmol/L PBS緩沖液)洗滌3次。各管中分別加入200 μL稀釋3 000倍的HRP－7G7，37℃孵育15 min后，用PBST洗滌3次。每管加入200 μL 10 g/L的TMB顯色劑，室溫下放置15 min，再加入50 μL 2 mol/L的H2SO4溶液，使反應終止。用移液槍吸取各管中的液體50 μL分別加入96孔酶標板的各孔中，在Bio－Rad550型酶標儀上測定A450nm值，用試劑空白孔調零。

1.4 復雜水樣的免疫磁珠捕獲富集

取20 μL 1 mg/mL的免疫磁珠添加到500 μL不同濃度蓖麻毒素的自來水、海水及OPCW考試水樣中，混合均勻后于37℃下孵育反應1 h。用磁力架沉淀吸附免疫磁珠，棄去上清液后，用1 mL的PBST分兩次洗滌除去與磁珠非特異性結合的化合物，然后用500 μL超純水分兩次洗滌除去體系中剩余的PBST。最后用35 μL 0.1%的三氟乙酸(TFA)對結合在磁珠上的蓖麻毒素進行洗脫，將洗脫液轉入新的離心管中，用10 kD超濾管在13 500 r/min下進行超濾，用20 mmol/L的PBS緩沖液溶劑置換3次，得到約100 μL上層保留液，用HPLC－Q－TOF/MS分析。將結果與未經(jīng)免疫捕獲富集的樣品進行比對，考察磁珠免疫捕獲后的方法學指標。

2 結果與討論

2.1 色譜－質譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 由于本文主要研究水樣基質中的蓖麻毒素，樣品組分相對單一，故選用5 μm粒徑的色譜柱，另外，由于樣品中蓖麻毒素的分子量遠大于4 000 Da，故選擇色譜柱孔徑為300。結合蓖麻毒素的性質及高效液相色譜的性能，比較了Proshell 300SB－C8(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，Zorbax 300SB －C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)以及Eclipse plus－C18(4.6 mm ×100 mm，5 μm)3種色譜柱對蓖麻毒素樣品的保留與檢測靈敏度。實驗結果表明:雖然100 mm柱長的色譜柱用時更短，但不能保證大分子樣品在色譜柱上有很好的保留。在柱長、柱徑、粒徑及孔徑相同的情況下，用C8柱分析得到的峰形比C18柱更好。因此，最終選用Proshell 300 SB－C8(4.6 mm ×150 mm，5 μm)色譜柱分離目標物。

2.1.2 洗脫梯度的優(yōu)化 以水(0.1%甲酸)－乙腈(0.1%甲酸)為流動相，研究了不同梯度條件下(見表1)的洗脫效果。實驗結果表明，乙腈含量高，目標化合物的信噪比高，檢測靈敏度高。但是對于復雜基質樣品，若乙腈含量過高，可能會使混合物分離不完全，峰形變差。采用表1中的梯度4，在分析時間較短的情況下，能夠保證蓖麻毒素與背景干擾物有很好的分離且靈敏度最高。

表1 復雜水樣基質中蓖麻毒素的梯度洗脫條件Table 1 The elution gradient of ricin in complex water samples

2.1.3 質譜條件的優(yōu)化 采用高分辨ESI+模式，在m/z 150～2 400范圍進行全掃描，由于目標化合物的分子量大，需要通過軟件的去卷積計算以得到分子量的準確測定值，因此對儀器的靈敏度、準確度都有較高要求。為減少質譜信號中的噪音，提高目標物的響應，考察了質譜的不同掃描頻率(1.1，1.3，1.5 spectra/s)、干燥氣流量(5，8，10 L/min)、噴霧壓力(20，30，40 psi)、干燥氣溫度(250，300，350℃)、毛細管電壓(3.2，3.5 kV)以及碎裂電壓(120，150，180 V)對分析結果的影響，確定最佳MS條件如“1.2”所示。

利用優(yōu)化得到的儀器采集參數(shù)，對蓖麻毒素純品進行分析，蓖麻毒素屬于大分子蛋白化合物，在HPLC－Q－TOF/MS中生成一系列 ［M+nH］n+多電荷離子(n為質子化數(shù)，即電荷數(shù))，利用去卷積軟件計算得到蓖麻毒素純品的分子量(見圖1)。4次重復實驗測得蓖麻毒素的分子量分別為:62 884.21，62 884.99，62 885.48，62 885.21 Da，其平均值為62 884.97 Da，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好。

圖1 HPLC－Q－TOF/MS分析蓖麻毒素得到的質譜圖(A)以及去卷積計算結果(B)Fig.1 HPLC－Q－TOF/MS spectrum of ricin(A)and its deconvolution result(B)

2.2 HPLC－Q－TOF/MS直接分析不同基質水樣

由于環(huán)境水樣中含有鹽類、醇類、脂類等背景干擾物，因此對目標物的分析會造成一定干擾。本實驗采用Agilent 1200/6520 HPLC－Q－TOF/MS系統(tǒng)結合蛋白分析專用色譜柱Agilent－proshell 300SB－C8，采用優(yōu)化的色譜－質譜條件，能夠將樣品中的蓖麻毒素與背景干擾物基本分離，從而可直接用于復雜水樣的分析。但不同樣品的背景復雜程度不同，分離效果不同，其檢測靈敏度也各不相同。用HPLCQ－TOF/MS直接對不同濃度的自來水、海水以及OPCW考試水樣中的蓖麻毒素進行分析，以3倍信噪比(S/N)時樣品的濃度為檢出限(LOD)，結果見表2。

表2 HPLC－Q－TOF MS直接分析不同基質水樣中蓖麻毒素的保留時間、檢出限及測得分子量Table 2 Retention times，LODs and determined masses of ricin directly analyzed by HPLC－Q－TOF MS in different water matrices

圖2為不同水樣中的1.00 ng/μL蓖麻毒素經(jīng)HPLC－Q－TOF/MS分析后的總離子流色譜圖，譜圖中積分的部分為蓖麻毒素的色譜峰。結果表明，OPCW考試用水的背景最復雜，基質中大量聚乙二醇、醇胺、磷酸酯、無機鹽類干擾物對蓖麻毒素的分析造成了嚴重干擾，使得蓖麻毒素的保留時間和分子量與標樣相比存在較大偏差，峰面積大大降低，僅能檢測濃度高于1.00 ng/μL的樣品。因此，雖然HPLC－Q－TOF/MS可以直接篩查不同基質水樣中的蓖麻毒素，但對于復雜背景干擾的基質樣品，分析靈敏度和準確性均較差，必須對復雜樣品中的目標蛋白進行有效的純化與富集后才能得到理想的分析結果。

圖2 HPLC－Q－TOF MS直接分析不同基質水樣中蓖麻毒素(1.00 ng/μL)的總離子流色譜圖Fig.2 TIC chromatograms of ricin(1.00 ng/μL)in different water matrices directly analyzed by HPLC－Q－TOF MS

2.3 復雜基質中蓖麻毒素的免疫磁珠富集與純化

2.3.1 抗體效價的測定 利用間接ELISA［18］方法考察了不同抗體的效價，通過實驗得到ELISA最低響應信號對應抗體的質量濃度，計算包被的蓖麻毒素濃度與抗體濃度的比值，從而得到抗體的效價。結果表明，抗體3G7的效價太低，僅為1∶50，不能用于實驗分析;而抗體6A6和7G7的效價分別達1∶2 800和1∶5 000，能夠滿足免疫分析的實驗需求，所以選擇抗體6A6和7G7進行實驗。

2.3.2 免疫捕獲富集方法的線性方程、回收率與精密度 分別配制濃度為0，0.01，0.10，1.00，2.00，5.00，10.0，25.0，50.0，100 μg/mL的蓖麻毒素，用ELISA－光度法繪制免疫磁珠捕獲檢測蓖麻毒素的標準曲線，以蓖麻毒素濃度的對數(shù)為X軸，對應A450nm值為Y軸，進行線性回歸計算。結果顯示，蓖麻毒素濃度在5.00～100 μg/mL范圍內，其對數(shù)與發(fā)光強度A450nm呈線性關系，回歸方程為Y=0.634X －0.347，r2為0.974。

在5.00～100 μg/mL線性范圍內配制加標濃度為15.0和30.0 μg/mL的蓖麻毒素樣品，采用免疫捕獲方法測定相應濃度樣品的A450nm值，每個樣品重復測定3次，以工作曲線計算對應樣品的濃度，并計算其回收率與相對標準偏差(RSD)。結果顯示，樣品在15.0，30.0 μg/mL加標濃度下的回收率分別為88.8%和82.1%，RSD分別為5.9%和4.2%。

2.3.3 免疫捕獲結合HPLC－Q－TOF/MS對復雜水樣的分析 將免疫捕獲富集技術與HPLC－QTOF/MS相結合用于復雜水樣的測定。圖2C及圖3分別為OPCW考試水樣在免疫磁珠富集前后的HPLC－Q－TOF/MS總離子流色譜圖。從圖中可以看出，免疫磁珠富集前(圖2C)，由于受到大量背景化合物的干擾，蓖麻毒素不能在色譜柱上很好地保留，保留時間明顯靠前，質譜響應較差。而經(jīng)免疫磁珠富集后，有效除去了OPCW考試水樣基質中的背景干擾物，使樣品的保留時間更接近標樣，且顯著提高了質譜響應信號與檢測靈敏度。

圖3 OPCW考試水樣中蓖麻毒素(1.00 ng/μL)經(jīng)免疫磁珠富集后的HPLC－Q－TOF/MS總離子流圖Fig.3 TIC chromatogram of OPCW test water(1.00 ng/μL)analyzed by HPLC －Q －TOF/MS after immunocapture enrichment

2.4 蓖麻毒素染毒樣品的分析

采用本文建立的免疫捕獲樣品前處理方法和優(yōu)化的液相色譜－質譜條件對自來水、海水及OPCW考試水等基質中不同濃度蓖麻毒素的加標樣品進行篩查分析，每個樣品重復測定3次，通過保留時間比對以及分子量測定確證了陽性樣品中的蓖麻毒素，并考察了不同基質樣品的檢出限，實驗結果見表3。由表3可見，經(jīng)過免疫捕獲，自來水和PBS基質中蓖麻毒素的檢出限達2.5 ng/mL，對于更加復雜的海水和OPCW考試水樣，檢出限分別達10，50 ng/mL，靈敏度比免疫捕獲之前提高了約20倍。

表3 蓖麻毒素染毒樣品分析的保留時間、檢出限及測得分子量Table 3 Retention times，LODs and determined masses of ricin contaminated samples

3 結論

基于免疫磁珠捕獲富集技術，結合高效液相色譜－四極桿/飛行時間質譜分析，建立了復雜水樣中蓖麻毒素的檢測方法。該方法快速、簡便、準確，可用于突發(fā)情況下可疑樣品中蓖麻毒素的快速篩查與確證，但由于方法檢測的是蓖麻毒素全蛋白，缺乏可靠內標物，還不能進行準確的定量分析。本文所建立的免疫磁珠富集方法，為真實染毒樣品的酶解－二級質譜鑒定提供了思路。在今后的工作中，本課題組將進一步對磁珠免疫捕獲后的蓖麻毒素樣品進行酶解，在酶解產(chǎn)物中篩選出蓖麻毒素序列特異性肽段，建立基于蓖麻毒素標識性肽段的準確定量的HPLC－MS/MS(MRM)方法，以形成初步完備的復雜樣品中蓖麻毒素的定性、定量質譜分析技術體系。

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