易錫斌，梁玉樹，黃曉琴，孫慧珍，江 楚，劉世琦*

(1．山東農業(yè)大學 園藝科學與工程學院，山東 泰安 271018;2．新希望集團，四川 成都 610023;3．山東農業(yè)大學化學材料與工程學院，山東 泰安 271018;4．新希望六和股份有限公司，山東 青島 266555)

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(Emamectin benzoate，簡稱甲維鹽)屬大環(huán)內酯類抗生素中的阿維菌素類生物農藥(Avermectins，AVMs)，主要成分為阿維菌素B1α(占90%以上)、阿維菌素B1β，甲維鹽B1α(占90%以上)、甲維鹽B1β，因此常以阿維菌素B1α和甲維鹽B1α為主要研究對象。阿維菌素類農藥具有很高的殺蟲活性，而甲維鹽作為一種新型高效的半合成生物源殺蟲劑，其藥效高于阿維菌素，是農作物中廣泛使用的殺蟲劑。甲維鹽對蜜蜂、鶴鶉、家蠶、斑馬魚具有高毒性，目前，歐盟規(guī)定其在稻米中的殘留限量為0.01 mg/kg，國際食品法典委員會(CAC)規(guī)定其在在棉籽中的殘留限量為0.02 mg/kg，我國則規(guī)定甲氨基阿維菌素在黃瓜、番茄中的殘留限量為0.02 mg/kg，在馬鈴薯、西葫蘆中的殘留限量為0.01 mg/kg［1］。吡蟲啉作為低毒殺蟲劑或殺菌劑常用于水果和蔬菜等農作物的病蟲害防治。日本“肯定列表”規(guī)定其在番茄中的殘留限量為2 mg/kg，CAC和歐盟的限量均為0.5 mg/kg，我國的限量標準規(guī)定其在黃瓜、番茄中的殘留限量為1 mg/kg，大白菜中的最低限量為0.2 mg/kg。茚蟲威是美國杜邦公司近年來開發(fā)生產的一種低毒殺蟲劑，常用于防治甘藍、花椰類、芥藍、番茄、辣椒、黃瓜等作物的蟲害。我國規(guī)定其在甘藍、菠菜的殘留限量3 mg/kg，芥藍、白菜的殘留限量為2 mg/kg。代森鋅在農業(yè)上常用來防治蔬菜、瓜果等的霜霉病、炭疽病、晚疫病、白腐病、黑斑病、黑星病等，屬于廣譜性、低毒類殺菌劑。盡管世界各國對其致癌機制和致畸性尚處于研究和爭議之中，但其使用廣泛、用量較大，毒性積蓄不可忽視。目前已有很多國家對食品中代森類農藥規(guī)定了最高殘留限量，其中日本“肯定列表”制度(以二硫代氨基甲酸酯計)規(guī)定了196種農產品中二硫代氨基甲酸酯的最高殘留限量;美國規(guī)定了74種農產品中代森錳鋅的最高殘留限量;澳大利亞規(guī)定了61種農產品中(以二硫代氨基甲酸酯計)代森鋅的最高殘留限量;我國規(guī)定此類農藥在蘆筍、番茄、黃瓜等農產品中的最高殘留限量為1～5 mg/kg，花生仁中的最低限量為0.1 mg/kg。

阿維菌素類農藥殘留的檢測方法有液相色譜－紫外法，但該類方法的靈敏度低;也有采用液相色譜－串聯(lián)質譜法［2－7］的報道，但是方法具有專屬性。吡蟲啉、茚蟲威常用液相色譜－紫外法進行檢測，目前已建立該兩種化合物在茶葉、蔬菜水果等農產品中殘留的液相色譜－串聯(lián)質譜的檢測方法［8－13］，但前處理操作復雜。代森鋅的檢測一直用衍生法，國家標準方法通過在酸性條件下用SnCl2還原，將其衍生成CS2后，用GC－ECD或FPD進行檢測，其前處理操作復雜，并且存在干擾。近年來，LCMS/MS方法也有報道，但該方法無論衍生后檢測還是直接檢測［16］均存在檢測成本高、效率低的問題。隨著人們對合用藥殘毒性關注度的不斷提高［17－18］，多殘留檢測日漸受到重視，同時檢測某一類藥物殘留量的方法也有較多報道，但未見同時檢測阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、吡蟲啉、茚蟲威及代森鋅5種農藥的報道。本文開發(fā)了同時檢測蔬菜中上述5種常用農藥的前處理方法，通過優(yōu)化儀器參數(shù)，建立了正、負離子同掃模式的UPLC－MS/MS方法。方法成本低、速度快、靈敏度高，可為研究阿維菌素等農藥在蔬菜中的殘留代謝規(guī)律、蔬菜的質量安全控制與監(jiān)測提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Triple Quad 4500液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質譜聯(lián)用儀，配電噴霧離子源(美國AB SCIEX公司)，AB－135型電子分析天平(梅特勒托利多上海有限公司);LD5－2B離心機(北京京立離心機有限公司);KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DF－18組織勻漿機(山東農業(yè)大學茶學系);RV100旋轉蒸發(fā)儀、旋渦混勻器MS3(德國IKA公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，默克公司);甲酸、乙酸銨、氨水(分析純，天津科密歐化學試劑有限公司);氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉、EDTA－Na2(分析純，國藥集團化學試劑有限公司);L-半胱氨酸(99%，阿拉丁試劑上海有限公司);阿維菌素、甲維鹽、吡蟲啉、茚蟲威、代森鋅(含量95%～99.5%，Sigma公司)。凈化材料:C18固相萃取小柱、石墨化碳小柱、弗羅里硅土小柱、中性氧化鋁小柱及其填料由天津博納艾杰爾科技有限公司和美國菲羅門公司(Phenomenex)提供。

豆角、辣椒、青菜、黃瓜、蘆筍、蕃茄樣品由山東農業(yè)大學實驗基地提供。

溶劑A:0.1%氫氧化鈉溶液。溶劑B:含10 mmol/L EDTA－Na2和10 mmol/L L-半胱氨酸的乙腈水溶液，稱取0.605 8 g L-半胱氨酸，1.861 2 g EDTA－Na2，用約50 mL水溶解后，加乙腈至500 mL。

標準物質儲備溶液:準確稱取適量的阿維菌素、甲維鹽、吡蟲啉、茚蟲威標準品，用甲醇配成質量濃度為100.0 mg/L的標準溶液;代森鋅標準品中加入2 mL溶劑A溶解后，加入溶劑B配制成1 000.0 mg/L的標準溶液，于4℃避光保存。

標準物質使用液:準確移取適量標準溶液，分別稀釋成阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、吡蟲啉及茚蟲威的質量濃度為5，10，25，50，100，200 μg/L;代森鋅的質量濃度為50，100，250，500，1 000，2 000 μg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 樣品處理

1.2.1 提取采集代表性樣品200 g，用食品加工機粉碎成粒徑不超過3 mm的精制樣。稱取5.00 g精制樣品于50 mL具塞離心管中，加入5.00 mL溶劑A，用組織勻漿機以11 000 r/min轉速勻漿30 s后，再加入15.00 mL溶劑B，加塞密封，于旋渦混勻器混合30 s后，置超聲波清洗器中于20℃ 超聲提取15 min，以4 800 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

1.2.2 凈化取提取液5 mL置于15 mL離心管中，加入0.2 g C18+0.05 g GCB，混勻渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min后，取上清液1 mL，過0.22 μm濾膜。取5 μL濾液進行UPLC－MS/MS分析。

1.3 色譜與質譜條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil BDS C18(100 mm×4.6 mm×5 μm);流動相A:10 mmol/L氨水，流動相B:100%乙腈;流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.5 min，20%B;0.5～1.5 min，20%～90%B;1.5～5.0 min，90%B;5.0～5.5 min，90%～20%B;5.5～6.5 min，保持20%B。

1.3.2 質譜條件 ESI正、負離子同掃模式，多反應監(jiān)測(MRM)參數(shù):氣簾氣40.0 psi，正離子化電壓4 500 V，負離子化電壓－5 500 V，離子源溫度250℃，電噴霧氣50 psi，輔助加熱氣55 psi，碰撞氣8 psi，駐留時間50 ms。優(yōu)化后的母離子Q1、子離子Q3、去簇電壓(Declustering potential)、碰撞能(Collision energy)、出口電壓(Collision cell exit potential)見表1。入口電壓10 eV，0.5～5.0 min采用閥切換入質譜，其余切換入廢液，0～1.5 min采集MRM負離子，1.5～6.5 min采集MRM正離子。

表1 MRM監(jiān)測模式下5種農藥的儀器優(yōu)化參數(shù)Table 1 Optimized parameters of multi－reaction monitoring for analysis of five pesticides

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

阿維菌素、甲維鹽、吡蟲啉、茚蟲威一般均選擇甲醇或乙腈提取，但代森鋅屬于乙撐雙二硫代氨基甲酸鹽類農藥，不溶于乙腈、甲醇等提取劑，需在堿性條件下轉化為水溶性的鹽類，用EDTA－Na2絡合Zn2+，在還原劑L-半胱氨酸保護下，以甲醇水或乙腈水提?。?6，19］。實驗比較了氨水、氫氧化鈉溶液對5種農藥的提取效果，結果表明，使用氨水時代森鋅無法轉化為可溶性鹽，回收率為0;分別采用0.05%，0.1%，1%的氫氧化鈉預處理后進行提取，5種藥物的回收率均在70%以上，雖然氫氧化鈉溶液在短時間內對藥物測定無明顯影響，但過高濃度的氫氧化鈉進入提取液時，將形成離子抑制效應，影響質譜檢測，從而導致代森鋅響應低或無響應。因此，最終確定采用0.1%的氫氧化鈉溶液。用含EDTA－Na2(10 mmol/L)和L-半胱氨酸(10 mmol/L)的乙腈水溶液配制混標溶液以考察標準溶液的穩(wěn)定性，結果顯示，48 h內濃度無明顯變化。故實驗選擇0.1%的氫氧化鈉溶液溶解和稀釋樣品，再采用含EDTA－Na2(10 mmol/L)和L-半胱氨酸(10 mmol/L)的乙腈水溶液進行提取。

2.2 凈化方法的選擇

蔬菜樣品提取液一般色澤較深，而且含有較多的有機質，常用弗羅里硅土、石墨化碳(GCB)、乙二胺－N-丙基甲硅烷(PSA)、C18作凈化柱。比較了弗羅里硅土、GCB、PSA、C18小柱等凈化方式對目標分析物的影響，結果顯示，GCB的去色素效果最好，但代森鋅、阿維菌素無回收，其他柱對青菜、辣椒等的色素幾乎無凈化效果，且優(yōu)化洗脫條件也不能使5種藥物的回收率同時達到70%以上。采用固相萃取小柱凈化雖然便于實現(xiàn)自動化操作，但實驗操作嚴格、費時，而且回收率不穩(wěn)定，由于5種農藥的極性相差大，難以找到合適極性的洗脫溶劑和洗脫體積，因此選擇基質分散固相萃取法。最終試驗顯示，每5 mL提取液采用0.2 g C18+0.05 g GCB進行基質分散固相萃取時，凈化效果和回收率符合檢測要求，故選取0.2 g C18+0.05 g GCB以基質分散固相萃取方式進行凈化。除辣椒、青菜的提取液略呈黃色，其他4種蔬菜的提取液均為無色。對凈化前后6種基質溶液進行光譜掃描，結果顯示，凈化后，溶液的近紫外光譜區(qū)至可見光譜區(qū)的吸收值下降并趨于平滑，說明凈化效果良好。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

在負離子模式下，對代森鋅進行母離子Q1掃描，代森鋅形成［M－Zn－H］－(m/z 210.8)，其他4種藥物采用正離子模式進行母離子Q1掃描，結果發(fā)現(xiàn)，阿維菌素的響應受離子源溫度的影響極大，在通常設定的溫度550℃條件，根本無法找到母離子，而且在未加入NH+4時形成的分子離子峰強度極弱，只掃描到極低豐度的加Na+峰，加入NH+4后［M+NH4］+(m/z 890.7)的強度大于 ［M+Na］+，幾乎無［M+H］+峰。甲維鹽在水溶液狀態(tài)下，電離出甲氨基阿維菌素(C49H75NO13)和苯甲酸鹽(C7H6NO2)，掃描到［M－C7H6O2+H］+(m/z 886.8)。吡蟲啉和茚蟲威的母離子均以［M+H］+形式存在，其質荷比分別為m/z 256.3，m/z 528.1。確定母離子后，再對母離子進行子離子掃描，從而確定子離子和碰撞能量?？疾炝穗x子源溫度(150，200，250，300，350，550℃)對5種藥物響應值的影響，結果顯示，阿維菌素的響應值隨溫度的上升而降低，其他藥物的響應值隨離子源溫度的上升而增強，阿維菌素響應值對離子源溫度變化曲線與代森鋅響應值對溫度曲線在200℃處相交(圖1)，結果顯示，200℃為最佳溫度，但考慮到同時檢測5種藥物應結合標準限量要求，因此最終確定離子源溫度為250℃。同時對質譜的毛細管電壓、錐孔電壓、脫溶劑氣和錐孔氣進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的質譜參數(shù)列于表1。為了最大限度去除水溶性雜質及有機質干擾，根據(jù)各分析目標物的相對保留時間對進入質譜前的流動相進行了閥切換，0.5～5.0 min切換入質譜，其余切換入廢液，0～1.5 min采集MRM負離子，1.5～6.5 min采集MRM正離子。選取離子豐度較強3個母子離子對，在MRM條件下，5種農藥的總離子流圖及選擇離子流圖見圖2。

圖1 5種農藥在不同離子源溫度條件下的響應值曲線圖Fig.1 Response values of five pesticides at different ion source temperature conditions

圖2 5種農藥在多反應監(jiān)測(MRM)模式下的總離子流圖(TIC)及選擇離子流譜圖Fig.2 Total and daughter ion current chromatograms of five pesticides solution under multiple reaction monitoring mode concentration of abamectin，emamectin benzoate，imidacloprid and indoxacarb:10 μg/L;concentration of zineb:100 μg/L

2.4 色譜柱與流動相的選擇

分別用C4、C18柱、陽離子交換柱、氨基柱進行實驗，發(fā)現(xiàn)5種藥物均能獲得良好分離，但阿維菌素在C4、陽離子交換柱、氨基柱上的保留時間長，且部分藥物峰形不對稱。而Hypersil BDS C18硅膠擔體鍵合前經(jīng)過專門的堿鈍化處理，極大地降低了殘余硅羥基與分析物之間的相互作用，從而改善了色譜峰形。

常用的流動相體系有:0.1%甲酸水－甲醇、0.1%甲酸水－乙腈、0.1%氨水－甲醇等，為了改善分離度，通常在流動相中添加乙酸銨或甲酸銨。本實驗發(fā)現(xiàn)，雖然在流動相中加入甲酸能有效消除峰形拖尾現(xiàn)象，大幅提高響應值［2］，但代森鋅無響應。參照文獻 ［18］，采用10 mmol/L氨水－乙腈體系，5種化合物均有較好的響應。優(yōu)化實驗條件下5種化合物的分離圖見圖2。

2.5 線性范圍、檢出限及定量下限

配制與待測樣品相同基質的混合標準系列工作液，其中阿維菌素、甲維鹽、吡蟲啉、茚蟲威的濃度梯度為5，10，25，50，100，200 μg/L，代森鋅的濃度梯度為50，100，250，500，1 000，2 000 μg/L，以選定的定量離子峰面積(y)對相應質量濃度(x，μg/L)作標準曲線，線性方程及相關系數(shù)列于表2。向空白樣品中添加目標化合物，按“1.2”方法進行處理后上機分析，以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比確定定量下限，并采用低、中、高3個加標水平將標準品溶液加入空白樣品中，按照“1.2”方法進行處理后上機分析進行回收率實驗，結果列于表2。結果顯示，在不同基質中，代森鋅的線性范圍為50～2 000 μg/L，其余4種農藥的線性范圍為5～200 μg/L，相關系數(shù)(r2)為0.995 1～0.999 9，表明方法的線性相關性良好;在所試驗的基質中，雖然代森鋅的檢出限較高，但能滿足限量標準要求，其他藥物的檢出限均低于1 μg/kg，定量下限在10 μg/kg以內，均滿足國外農藥殘留限量標準以及我國農藥殘留限量標準GB 2763－2014標準限量［1］要求?；厥章什坏陀?0.8%，RSD均不高于13.9%，符合國內外法規(guī)對農藥殘留檢測方法的質量控制要求。

2.6 實際樣品的測定

應用本方法對周邊市場所購買的豆角、辣椒、青菜、黃瓜、蘆筍、蕃茄等36個蔬菜樣品進行檢測，其中吡蟲啉的檢出比例為5%，含量為1.5～16.4 μg/kg，主要存在于豆角樣品。黃瓜樣品中檢出的阿維菌素均低于定量下限。其它樣品未檢出此5種農藥殘留。

表2 5種農藥的線性方程、相關系數(shù)、檢出限、定量下限及加標回收率Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LODs)，limits of quantitation(LOQs)and spiked recoveries of five pesticides

3 結論

本文建立了UPLC－MS/MS同時檢測蔬菜中阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(甲維鹽)、吡蟲啉、茚蟲威、代森鋅的分析方法。研究表明，5種農藥的加標回收率為70.8%～103.6%，相對標準偏差(n=5)為4.5%～13.9%，阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、吡蟲啉、茚蟲威在5種蔬菜中的檢出限為0.02～0.7 μg/kg，定量下限為0.07～2.3 μg/kg，代森鋅的檢出限為8.2～30 μg/kg，定量下限為27～100 μg/kg。方法快捷、操作簡單、環(huán)保、結果準確，符合相關法律法規(guī)要求，滿足日常檢測需要。

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