譚素媚 聶立欣 付強(qiáng)

（1，廣東省肇慶市農(nóng)業(yè)學(xué)校 526070；2，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 528231）

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

譚素媚1聶立欣1付強(qiáng)2*

（1，廣東省肇慶市農(nóng)業(yè)學(xué)校 526070；2，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 528231）

豬傳染性胸膜肺炎是一種高度傳染性呼吸道疾病，影響全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。本研究采用多種培養(yǎng)基進(jìn)行接種培養(yǎng)，從具有豬傳染性胸膜肺炎臨床癥狀病死豬的肺臟和胸腔滲出液分離到革蘭氏陰性桿菌，通過細(xì)菌分離、涂片染色鏡檢、衛(wèi)星現(xiàn)象試驗(yàn)、V因子依賴性試驗(yàn)診斷，最終確定所分離的細(xì)菌為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌。通過藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該分離菌對(duì)氟苯尼考、強(qiáng)力霉素和先鋒Ⅵ等藥物高度敏感，研究結(jié)果為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌病的診斷及治療提供指導(dǎo)意義，同時(shí)也為進(jìn)一步研究豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

豬；傳染性胸膜肺炎放線桿菌；病原分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌引起的豬的一種高度傳染性呼吸道疾病。該病主要表現(xiàn)為急性出血性纖維素性肺炎、慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎，急性發(fā)病死亡率高，是當(dāng)今危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病[1]，嚴(yán)重危害著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

在規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)中，豬傳染性胸膜肺炎容易引起群發(fā)性死亡，造成較大損失[2]。2014年10月，廣東省肇慶某豬場(chǎng)3月齡的豬發(fā)病并出現(xiàn)大量死亡。臨床主要表現(xiàn)為被毛松亂、體溫升高，耳、鼻及四肢皮膚呈藍(lán)紫色，咳嗽、呼吸極度困難，有的呈犬坐姿勢(shì)，臨死前口鼻孔流出血色或白色的泡沫。剖檢見胸腔含有粉紅色液體，心包積液，纖維素性心包炎，纖維素性腹膜炎、肺炎，胸壁和肺粘連很嚴(yán)重。為更好的控制該病，本實(shí)驗(yàn)通過病原分離鑒定確定細(xì)菌，并以此為依據(jù)做藥物敏感性試驗(yàn)，提出合理的防治方案。

1 材料和方法

1.1 試劑和培養(yǎng)基

生化微量鑒定管、培養(yǎng)基、藥敏紙片等均購于廣州瑞舒生物科技公司；金黃色葡萄球菌及V因子（NAD，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）為佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 V因子需要試驗(yàn)

分離菌株分別接種于含有終濃度為0.01%V因子和無V因子的普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在37℃需氧和厭氧條件下培養(yǎng)24～48h后，觀察和記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 衛(wèi)星現(xiàn)象試驗(yàn)

將鮮血瓊脂培養(yǎng)基劃線接種金黃色葡萄球菌并垂直劃線分離的細(xì)菌，37℃培養(yǎng)24～48h。

1.4 生化鑒定

用分離菌純培養(yǎng)物進(jìn)行下列試驗(yàn)：硝酸鹽還原、尿素酶、靛基質(zhì)、MR、VP試驗(yàn)、葡萄糖、乳糖、硫化氫、接觸酶、水楊苷、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、果糖、木糖、檸檬酸鹽、山梨醇等糖發(fā)酵試驗(yàn)[3]。接種前在發(fā)酵管中加入2μL的1%的NAD。

1.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

蘸取分離菌的肉湯培養(yǎng)物，接種于血瓊脂平板，將各種藥敏紙片分別平貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢結(jié)果

病料接種于巧克力培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)菌落為露珠狀、約2～3mm大小，閃光不透明。經(jīng)革蘭氏染色，可見革蘭氏陰性球桿菌，菌體細(xì)小，也可見桿狀、絲狀散在菌體（見圖1）。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)特征

在普通平板、麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)；在巧克力培養(yǎng)基上長(zhǎng)成針尖大、灰白色、圓形隆起、閃光不透明的菌落；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)成更細(xì)小的透明菌落，密集時(shí)可看到形成一片β溶血區(qū)；挑取菌落染色鏡檢，符合豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的形態(tài)和染色特征。對(duì)比兩種營(yíng)養(yǎng)肉湯的渾濁度發(fā)現(xiàn)，添加了V因子的肉湯比不添加V因子的肉湯渾濁（見圖2），生長(zhǎng)更旺盛，表明該分離菌生長(zhǎng)依賴V因子。

圖1 分離細(xì)菌的顯微形態(tài)（10×100，革蘭氏染色）

衛(wèi)星現(xiàn)象：普通瓊脂平板上金黃色葡萄球菌線兩側(cè)有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長(zhǎng)，離金黃色葡萄球菌越近菌落越大，越遠(yuǎn)菌落越小，遠(yuǎn)離葡萄球菌的地方甚至不生長(zhǎng)，呈現(xiàn)出明顯的 “衛(wèi)星現(xiàn)象”。在分離菌和金黃色葡萄球菌的分界線處出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象，表明分離菌與金黃色葡萄球菌具有協(xié)同溶血的作用。

圖2 分離菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，分離菌能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖和麥芽糖等；脲酶試驗(yàn)陽性，接觸酶陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性。

表1 分離菌的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對(duì)氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、壯觀霉素、阿米卡星、鏈霉素、先鋒Ⅵ、哌拉西林、諾氟沙星、頭孢拉定高度敏感；對(duì)紅霉素、四環(huán)素中度敏感；對(duì)卡那霉素芐青霉素、慶大霉素為低度敏感，對(duì)氨芐西林、青霉素為耐藥（見表2）。

表2 分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究從肇慶市某豬場(chǎng)采集病料，發(fā)現(xiàn)分離菌為需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性短桿菌、球桿菌，偶爾有長(zhǎng)絲狀的多種形態(tài)細(xì)菌；營(yíng)養(yǎng)需求較高，生長(zhǎng)依賴V因子，在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上為透明的粘液型菌落等培養(yǎng)特性與大多APP報(bào)道的特性一致[4，5]。生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尿素酶、V因子依賴性、溶血性和木糖為陽性與標(biāo)準(zhǔn)菌株的指標(biāo)一致。分離菌株大多數(shù)生化特性符合前人研究胸膜肺炎放線桿菌的結(jié)果，僅有幾項(xiàng)指標(biāo)與前期資料所介紹的不一致，可能由于APP營(yíng)養(yǎng)要求較高而常規(guī)的生化發(fā)酵管營(yíng)養(yǎng)成分不足或較低導(dǎo)致發(fā)酵遲緩，甚至出現(xiàn)假陰性。結(jié)合發(fā)病豬群的流行病學(xué)特征、臨床癥狀、病死仔豬的組織病理變化和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)此分離菌為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌。此類胸膜肺炎放線桿菌屬于生物Ⅰ型，即依賴V因子（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD輔酶）生長(zhǎng)的原胸膜肺炎嗜血桿菌。進(jìn)一步對(duì)分離菌株進(jìn)行血清型鑒定和致病力研究，將有助于闡明豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的致病機(jī)制。

分離菌對(duì)氟苯尼考、強(qiáng)力霉素和先鋒Ⅵ高度敏感（這三種抗菌素被推薦為臨床用藥），對(duì)四環(huán)素、鏈霉素等藥物敏感低，青霉素等不敏感，表明大多數(shù)藥物對(duì)胸膜放線桿菌敏感性不高，也有可能是與這些藥物在豬場(chǎng)的使用頻率高有關(guān)。由于本病的蔓延流行和抗菌藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用，出現(xiàn)較多的耐藥菌株，因此采用藥物治療時(shí)最好進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇有效敏感藥物進(jìn)行治療，才可獲得較好的效果。防治本病除了使用較敏感的抗生素外，還應(yīng)進(jìn)行定期的免疫接種，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，應(yīng)避免豬群擁擠，加強(qiáng)通風(fēng)。這次在肇慶豬場(chǎng)發(fā)生這種疾病，可能就是由于氣候條件的改變所引起，是否與血清型有關(guān)需要進(jìn)一步的研究。

[1]厚華艷,梁武,呂茂杰,楊保收,等.豬傳染性胸膜肺炎亞單位疫苗研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36（2）:84-88.

[2]Frey J,Beck M,Nicolet J,Toxin typing of action-bacillus pleurpneumoniae by PCR[J].Veterinary Bulletin,1996,66（8）:5109.

[3]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第2版）[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002.

[4]劉春花,張彥明,等.胸膜肺炎放線桿菌研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2003,23（2）:206-208.

[5]張彥明,劉春花,等.胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及免疫預(yù)防[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2002,32（5）:21-22.

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014A030310020）和廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2014KQNCX179）資助。

付強(qiáng)（1983-），男，博士，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。