辛 一 , 路延篤 徐 健

(1. 中國科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所 單細(xì)胞中心, 山東 青島 266101； 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

微藻是一類在自然界中分布廣泛的光合單細(xì)胞生物的總稱[1]。在逆境脅迫時, 許多微藻可在胞內(nèi)大量積累三脂酰甘油(triacylglycerol, TAG), 因此, 開發(fā)微藻產(chǎn)油被視作未來生物能源的一個重要發(fā)展方向[2]。目前,該領(lǐng)域主要側(cè)重于優(yōu)良藻種的選育, 但對微藻合成TAG的代謝和調(diào)控機(jī)制仍然了解得不夠全面。

在高等動、植物中, TAG生物合成的研究較為深入, Kennedy途徑是其中最重要的合成途徑之一[3],根據(jù)組學(xué)分析和功能基因鑒定可知, 該途徑也在微藻TAG的合成中發(fā)揮重要作用[4]。在Kennedy途徑中, 三個脂酰輔酶 A依次將脂?；D(zhuǎn)移到甘油-3-磷酸上, 最終形成TAG, 脂酰輔酶A： 二脂酰甘油?；D(zhuǎn) 移 酶 (acyl-CoA： diacylglycerol acyltransferase,DGAT)作為該途徑的限速酶[5], 催化第三個脂酰輔酶A與二?；视?diacylglycerol, DAG)形成TAG。目前共發(fā)現(xiàn)三種DGAT亞家族——DGAT1、DGAT2和DGAT3。其中, DGAT1屬于膜結(jié)合的O-?；D(zhuǎn)移酶家族, 含有至少 6個跨膜區(qū)[6]。DGAT1在高等植物種子的油脂積累中發(fā)揮重要作用, 其表達(dá)水平還影響著 TAG的脂肪酸鏈組成[7]。在三角褐脂藻中,DGAT1對飽和的C16和C18底物具有偏好性, 且利用可變剪切來調(diào)節(jié)其TAG合成酶的活性[8]。

微擬球藻(Nannochloropsis spp.)是一類單細(xì)胞真核微藻, 屬于不等鞭毛亞門, 真眼點(diǎn)藻綱, 屬內(nèi)目前已命名6個種[9]。由于其具備含油量較高、生長速度較快等特點(diǎn), 因而被視為最具工業(yè)應(yīng)用潛力的產(chǎn)油微藻之一[10]。由于微擬球藻在自然界中廣泛分布,且位于海洋食物鏈的起始端, 因此研究其包括 TAG合成在內(nèi)的碳流分配, 對于理解海洋碳循環(huán)也具有重要意義[11]。此外, 微擬球藻還能合成二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)等高附加值產(chǎn)品, 在食品及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[12]。目前微擬球藻的轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)組分析提示, I型DGAT的編碼基因之一NoDGAT1A在缺氮12 h后表達(dá)量上調(diào), 而且許多含有EPA的TAG含量也從此時開始出現(xiàn)顯著增長,表明NoDGAT1A可能在合成含有EPA的TAG時發(fā)揮重要作用[13-14]。本研究從微擬球藻高產(chǎn)油藻株 N.oceanicaIMET1的cDNA序列中克隆出NoDGAT1A,并將該基因在TAG合成突變的酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),考察NoDGAT1A在TAG合成中的生理功能, 這為構(gòu)建微藻產(chǎn)油關(guān)鍵基因的功能網(wǎng)絡(luò)提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藻種培養(yǎng)與cDNA制備

以優(yōu)化后的f/2半海水培養(yǎng)基(鹽度1.5, 400 mg/L KNO3, 38.5 mg/L NaH2PO4, 12 mg/L FeCl3, 4 mg/L Na2EDTA, 0.9 mg/L MnCl2, 50 μg/L CuSO4, 42 μg/L NaMoO4, 98 μg/L ZnSO4, 44 μg/L CoCl2, 100 μg/L Vitamin B1, 0.5 μg/L Vitamin H, 0.5 μg/L Vitamin B12)在 25℃和 50 μmol/(m2·s)進(jìn)行培養(yǎng)微擬球藻藻株IMET1。待藻液培養(yǎng)至適宜濃度時, 以水平轉(zhuǎn)速3 000 g離心20 min, 將收集到的藻體與直徑0.1～0.2 mm玻璃珠混合, 使用 FastPrep-24快速核酸提取儀以6.5 m/s振蕩1 min使細(xì)胞破碎, 用HP Plant DNA Kit(Omega)提取DNA。隨后, 將冷凍保存的藻體在液氮中充分研磨, 采用 TRIzol (Invitrogen)試劑盒進(jìn)行總RNA的提取, 再用 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Takara)以隨機(jī)引物合成cDNA[15]。

1.2 NoDGAT1A的克隆與序列分析

利用常規(guī)PCR技術(shù)從IMET1的cDNA中克隆NoDGAT1A, 并在基因5′端和3′端分別引入酶切位點(diǎn)BamHI和NotI。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的IMET-1基因組和缺氮誘導(dǎo)產(chǎn)油過程的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)數(shù)據(jù)[13-14]所設(shè)計(jì)的 正 向 引 物 為 5′ GGATCCACATAATGTCTAT GCACAAACTGACTCG, 反 向 引 物 為 5′ TGCG GCCGCCTAAAGAGCGCTCT。PCR 反應(yīng)體系 50 μL,包括 4 μLdNTP (2.5 mmol/L), 正反向引物各 2 μL(10 μmol/L), 5 μL 10×buffer (Mg2+plus), 0.4 μL rTaq酶(5 U/μL, TAKARA), 1 μL cDNA 模板, 以及 35.6 μL超純水。反應(yīng)過程如下： 起始94℃預(yù)變性3 min, 然后94℃變性30 sec, 55℃退火30 sec, 72℃延伸1 min,30個循環(huán), 最后72℃反應(yīng)7 min。用Gel Extraction Kit (Omega)從PCR產(chǎn)物中回收目的片段, 連入pMD 18-T 載體(Takara), 并轉(zhuǎn)入大腸桿菌 Trans5α(Transgene)中, 陽性克隆送至Invitrogen公司測序確認(rèn)后, 于-80℃保存。

氨基酸序列的相似度利用 NCBI中的 Blastp(http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)行比較, 采用 在 線 軟 件 TMHMM (http： //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行疏水性預(yù)測分析, 用MEGA4.0[16]分析, 用MEGA4.0[16]重建 DGAT氨基酸序列的鄰接樹,所有節(jié)點(diǎn)的可靠性通過1 000次重抽樣分析進(jìn)行評價。

1.3 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化

本課題所用的酵母表達(dá)載體 pXJ401是以pYES2.0 (Invitrogen)為骨架構(gòu)建的, 主要步驟如下：用Plasmid Mini Kit I (Omega)從上述Trans5α轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒后, 在37℃下, 使用NEB公司的限制性內(nèi)切酶 BamHI和 NotI分別對 pYES2.0和含有NoDGAT1A的pMD18-T載體進(jìn)行雙酶切。從酶切產(chǎn)物中回收目的片段, 再用 T4連接酶 (Thermo)將NoDGAT1A連入 pYES2.0。同時, 將酵母的Ⅱ型DGAT編碼基因DGA1連入pYES2.0作為正對照。本研究所采用的營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母突變體 H1246由Stymne教授提供[17]。酵母轉(zhuǎn)化采用醋酸鋰熱激轉(zhuǎn)化法[18], 將得到的單菌落接入SC液體篩選培養(yǎng)基中,置于30℃搖床中培養(yǎng)至平臺期, 將PCR檢測結(jié)果為陽性的菌液于-80℃保存。

1.4 酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)與油脂分析

誘導(dǎo)表達(dá)時, 將上述轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)至對數(shù)期, 再接入含有 2%半乳糖(w/v)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中, 初始OD600值為 0.4, 置于 30℃搖床中培養(yǎng)至平臺期。誘導(dǎo)開始時, 向菌液中施加或不施加EPA溶液(過濾除菌, 終濃度90 μmol/L)。酵母油脂的提取參考Bligh和 Dyer發(fā)明的氯仿-甲醇法[19]。酵母總脂的薄層層析分離參考 Ghosal的方法[20], 當(dāng)可觀察到清晰的斑點(diǎn)時, 將含有TAG的硅膠點(diǎn)刮下, 并用Agilent氣相色譜-四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀分析上述 TAG的甲酯化產(chǎn)物。各脂肪酸鏈的量依據(jù)其與內(nèi)標(biāo)物(正十九烷酸)的峰面積比值以及各樣品中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 NoDGAT1A的序列特征

根據(jù)本課題組的前期工作[13-14], 利用 PCR和3730測序技術(shù), 從 IMET1的 cDNA中得到了NoDGAT1A的全序列。該基因的ORF區(qū)全長為1314 bp,共編碼437個氨基酸。氨基酸序列的BLAST結(jié)果表明, NoDGAT1A與擬南芥 DGAT1的相似度為 38%,而且 NoDGAT1A編碼的氨基酸序列中含有MBOAT(membrane bound O-acyltransferase)這一多數(shù)DGAT1共有的結(jié)構(gòu)域。TMHMM分析結(jié)果表明,NoDGAT1A中至少含有9段高疏水區(qū)(圖1), 這些高疏水區(qū)可能是該蛋白的跨膜區(qū)。此外, 在鄰接法構(gòu)建的DGAT進(jìn)化樹(圖2)中, NoDGAT1A位于DGAT1分支, 并與硅藻(三角褐脂藻及假微型海鏈藻)的進(jìn)化距離較近。由此可知, NoDGAT1A符合Ⅰ型DGAT序列的一般特征。

圖1 NoDGAT1A的疏水性分析Fig.1 Hydrophobicity plots of NoDGAT1A (predicted using the TMHMM server)

2.2 NoDGAT1A的TAG合成酶活性

在釀酒酵母 S. cerevisiae中, DGA1、LRO1、ARE1和 ARE2負(fù)責(zé)其幾乎全部 TAG的合成, 鑒于此,Stymne等從野生型酵母菌株SCY62中敲除了上述4個基因, 構(gòu)建了基本能夠正常生長、但無法合成TAG的突變株 H1246[17]。由于該突變株具有清晰的遺傳背景和良好的可操作性, 因而被廣泛用于 TAG合成通路的研究中[8,21-22]。為了鑒別NoDGAT1A是否具有TAG合成活性, 本研究將NoDGAT1A連接在酵母表達(dá)載體pYES2.0上, 轉(zhuǎn)化入酵母突變株H1246中。并以克隆有酵母內(nèi)源DGAT基因DGA1的pYES2.0作為正對照, 以pYES2.0空載體作為負(fù)對照。

圖2 三類DGAT亞家族的鄰接樹Fig.2 A neighbor-joining phylogram showing relationships among NoDGAT1A and diverse hypothetical and characterized DGAT-like proteins from diatoms, higher plants and animals

EPA是微擬球藻 TAG的重要組分, 而酵母的TAG中不存在 EPA[17]。鑒于此, 本研究向上述三種H1246的轉(zhuǎn)化子中分別加入等量的 EPA底物, 以考察其對NoDGAT1A合成TAG的影響。隨后, 將上述六種樣品經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后, 分別于平臺期提取總油脂, 進(jìn)行薄層層析實(shí)驗(yàn), 由圖3可見, 在施加或未施加EPA時, 負(fù)對照酵母株均無TAG積累； 正對照酵母株在施加或未施加EPA時, 均積累了明顯的TAG點(diǎn)； 而表達(dá)有 NoDGAT1A的工程株, 只有在外加EPA的情況下, 才有 TAG產(chǎn)生。該結(jié)果提示, NoDGAT1A具備脂酰輔酶A： 二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性,且EPA是其合成TAG時所需的底物或誘導(dǎo)物。

2.3 NoDGAT1A的底物偏好性

圖3 NoDGAT1A在H1246中的TAG合成酶活性Fig.3 Complementation of the TAG-deficient phenotype of the yeast mutant H1246 by expression of NoDGAT1A, DGA1 or empty pYES2

圖4 NoDGAT1A與DGA1催化合成的TAG中脂肪酸鏈的差異比較Fig.4 Comparison of fatty acid contents in TAGs between the H1246 yeast strains that respectively expressed NoDGAT1A and DGA1

為了鑒定NoDGAT1A的脂肪酸底物偏好性, 本研究進(jìn)一步將上述表達(dá)NoDGAT1A或DGA1的工程株產(chǎn)生的TAG樣品, 從TLC薄板上分離出來, 并分別進(jìn)行甲酯化, 再采用GC-MS進(jìn)行分析。如圖4所示, 在NoDGAT1A和DGA1催化合成的TAG中, 16：0和18： 0都是主要的脂肪酸鏈成分。而與DGA1相比, NoDGAT1A催化合成的TAG含有較多的16： 0和 EPA(20： 5), 尤其是 EPA 的含量遠(yuǎn)高于 DGA1(P＜0.001)。由此可以推測, 微擬球藻TAG中含有的較高含量的EPA, 可能與其DGAT1A的活性有關(guān)。

綜上所述, NoDGAT1A具有Ⅰ型DGAT的序列特征, 且在EPA誘導(dǎo)下, 可催化TAG合成。與酵母內(nèi)源DGAT(DGA1)相比, NoDGAT1A催化合成的TAG含有更高比例的EPA, 表明它對其含有EPA的TAG的合成具有一定貢獻(xiàn)。由于EPA是微擬球藻油脂的重要組分, 作為一種高值副產(chǎn)品能夠提高微藻產(chǎn)油的經(jīng)濟(jì)性, 因此, 上述發(fā)現(xiàn)對微藻合成EPA和TAG的機(jī)制具有一定啟示。

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