劉 杰, 卜蒙蒙, 孫 景, 王延鵬, 李慧鵬, 張德超

(1. 青島科技大學(xué) 生物工程與技術(shù)系, 山東 青島 266042； 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 海洋生物分類與系統(tǒng)演化實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071)

庫(kù)頁(yè)島屬俄羅斯最大的島嶼, 面積 7.64萬(wàn) km2,大陸性氣候, 冬季氣候寒冷, 夏季涼爽多霧。該島地處北太平洋, 位于我國(guó)黑龍江出?？诘臇|部, 東、北面臨鄂霍次克海, 西隔韃靼海峽及涅韋爾斯科伊海峽并與俄羅斯哈巴羅夫斯克邊疆區(qū)相望, 南隔宗谷海峽與日本北海道宗谷岬相對(duì)。庫(kù)頁(yè)島上現(xiàn)有6 000多條河流和1 600余個(gè)湖泊, 其自然生態(tài)環(huán)境受人類活動(dòng)干擾較少,同時(shí)來(lái)自鄂霍次克海西岸的沉積物源, 其形成速率、厚度和有機(jī)碳含量等均為各類微生物生長(zhǎng)提供了良好而獨(dú)特的生存環(huán)境。一般來(lái)說(shuō), 特殊生態(tài)環(huán)境是獲取微生物新種質(zhì)資源的有效途徑, 也是進(jìn)行微生物新型生物活性物質(zhì)研發(fā)的基礎(chǔ)。而庫(kù)頁(yè)島區(qū)域(包括潮間帶)這類特殊生境的微生物多樣性狀況如何, 至今尚未見(jiàn)報(bào)道過(guò)。

本研究于2013年9月份從庫(kù)頁(yè)島潮間帶的4個(gè)采樣點(diǎn)采集了沉積物樣本若干份, 然后利用2216E、R2A、M1三種常規(guī)、寡營(yíng)養(yǎng)海洋細(xì)菌培養(yǎng)基, 對(duì)其可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離、純化和基于 16S rRNA 基因序列測(cè)定的系統(tǒng)發(fā)育分析, 目的在于了解庫(kù)頁(yè)島特殊生態(tài)區(qū)潮間帶沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性狀況,尋找和發(fā)現(xiàn)新的物種或分類單元。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

4份沉積物樣品分別于 2013年 9月 6日—11日采集于俄羅斯庫(kù)頁(yè)島潮間帶, 地理坐標(biāo)分別是：R-1 (47°08'30.1”N/142°03'30.1”E), R-2(46°56'39.3”N/143°05'46.7”E), R-3 (46°25'3.3”N/141°51'0.7”E) 和R-4(48°00'48.6”N/142°82'14.3”E)。去掉樣品表層約5 cm, 采集5～20 cm處沉積物樣品, 用滅菌的50 mL離心管 4℃暫時(shí)保存, 帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行菌株分離。所有采樣工具均事先經(jīng)過(guò)無(wú)菌消毒。

1.1.2 分離培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基(H)： 蛋白胨5 g, 酵母提取物1 g,瓊脂15 g。用1 000 mL 海水配制, pH 7.5。

R2A培養(yǎng)基(R)： 蛋白胨0.5 g, 酵母提取物0.5 g,葡萄糖0.5 g, 淀粉0.5 g, K2HPO40.3 g, MgSO40.05 g,丙酮酸鈉0.3 g , 瓊脂15 g。用1 000 mL 海水配制,pH 7.0。

M1培養(yǎng)基(M)： 蛋白胨2 g, 酵母提取物1 g, 可溶性淀粉10 g , 瓊脂15 g。用1 000 mL海水配制, pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 海洋細(xì)菌的分離

分別稱取沉積物樣品2 g, 加入到無(wú)菌的0.1%焦磷酸鈉溶液中, 在25 ℃、150 r/min條件下振蕩20 min。用生理鹽水(0.9%, NaCl)對(duì)樣品進(jìn)行10倍系列稀釋,涂布在三種不同的固體培養(yǎng)基上, 25℃培養(yǎng) 7 d, 根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征挑取不同單菌落, 每個(gè)菌落純化至少 2次。鏡檢合格后進(jìn)行革蘭氏染色和菌體形態(tài)觀察拍照, 用 25%甘油將純化菌株保存于-80℃超低溫冰箱。所有步驟均按無(wú)菌操作進(jìn)行。

1.2.2 海洋細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

分離純化菌株用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法[1]進(jìn)行細(xì)菌總DNA的提取。PCR采用細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物, 27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′), 1541r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR 反應(yīng)條件(30 個(gè)循環(huán))： 94 ℃預(yù)變性, 4 min； 94 ℃變性 1 min； 55 ℃復(fù)性 1 min； 72 ℃延伸 1 min, 共 30個(gè)循環(huán)； 最后 72 ℃延伸 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳, 獲得約 1.5 Kb的單一條帶,再經(jīng)切膠和試劑盒(天根生化科技有限公司產(chǎn)品)純化后, 送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向全長(zhǎng)序列測(cè)定。序列通過(guò)在 NCBI網(wǎng)站 GenBank進(jìn)行Blastn比對(duì), 找到相似性最高且是有效發(fā)表的典型菌株序列, 用 Clustal X 和 Mega 5.0軟件(采用Neighbor-joining方法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

本研究首先采用 27f單向引物對(duì)分離菌株進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序, 然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果比對(duì)后進(jìn)行排重, 剩余菌株再進(jìn)行 27f、1541r雙向引物的全長(zhǎng)序列測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的測(cè)序結(jié)果與比對(duì)

本研究從采集樣品中共分離得到82株可培養(yǎng)細(xì)菌菌株。經(jīng)菌前期菌落、菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色、以及27f單引物初步測(cè)序后進(jìn)行排重, 最終合并選取其中45株代表性菌進(jìn)行雙向全長(zhǎng)16S rRNA基因(1.4～1.5 kb)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)在NCBI的GenBank中比對(duì)后, 發(fā)現(xiàn)它們主要分布在4個(gè)門(mén)、6個(gè)綱、27個(gè)屬、44個(gè)種之中(表1)。其中變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌群(19株), 占所選45株代表菌比對(duì)種類的42.2%； 放 線 菌 門(mén) (Actinobacteria)、 厚 壁 菌 門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)分別占總體的20.0%、20.0% 和 17.8%。從45株代表性菌的分離培養(yǎng)基來(lái)看, 有28株是2216E培養(yǎng)基分離得到的, 剩余17株菌是R2A、M1寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基分離得到的。

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

將 45株代表菌的 16S rRNA基因序列提交GenBank進(jìn)行注冊(cè)(序列號(hào)為： KJ456596, KJ456597,KM362864-KM362906), 同時(shí)參考 Genbank和韓國(guó)EzTaxon 網(wǎng)站的比對(duì)結(jié)果及相關(guān)典型菌株序列, 利用軟件 Clustal X 和 Mega 5.0并采用 Neighborjoining方法, 分別構(gòu)建了變形桿菌門(mén)和擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分別見(jiàn)圖1、圖2。從圖1和表1可以看出, 本研究分離的優(yōu)勢(shì)菌為變形桿菌門(mén)(19株, 占45株代表菌比對(duì)種類的42.2%), 分布于α- Proteobacteria和γ- Proteobacteria兩個(gè)綱。分布于α- Proteobacteria的菌株主要包括紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)。

其中屬于紅細(xì)菌目的有： 副球菌屬(Paracoccus)、簡(jiǎn)納西氏菌屬(Jannaschia)、熱帶單胞屬(Tropicimonas)、十八桿菌屬(Octadecabacter)、淺玫瑰色洛克氏菌屬(Loktanella)、居黃海屬(Seohaeicola)和亞硫酸鹽桿菌屬(Sulfitobacter)。從16S rDNA 序列相似性來(lái)看, 菌株R-1-M-3同分離自日本海Chazhma Bay沉積物的淺玫瑰色洛克氏菌(L.rosea)[2]的相似性為 99.7%；菌株 R-3-M-5-3同來(lái)自韓國(guó)東海海水的海亞硫酸鹽桿菌(Sulfitobacter marinus)[3]的相似性為 99.8%； 菌株R-3-H-5同來(lái)自日本海Troitza Bay海草的可疑亞硫酸鹽桿菌(S.dubius)[4]的相似性為99.6%； 而菌株R-1-H-3、R-4-M-3、R-1-R-9和R-2-R-1同它們系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的模式菌株相似性均在97.3 %～98.1%之間, 以相似性大于98.5%作為同一個(gè)物種來(lái)估算[5-6](前提是 DNA-DNA雜交同源性≥70%, 且有獨(dú)特生理生化等表型性狀), 這 4株細(xì)菌有可能分別代表著副球菌屬、熱帶單胞屬、十八桿菌屬和居黃海屬內(nèi)的潛在新種。在鞘脂單胞菌目中只有 R-1-M-12、R-1-R-17和 R-1-M-4-1 這 3株菌, 均屬于色桿菌屬(Erythrobacter)。其中菌株R-1-M-12與分離自日本神奈川的Aburatsubo內(nèi)灣海藻的長(zhǎng)紅色桿菌(Erythrobacter longus)[7]的16S rRNA基因序列相似性為99.7 %； 菌株 R-1-M-4-1 與潮汐紅色桿菌的模式菌株E. gaetbuliSW-161T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近[8], 16S rRNA基因序列相似性僅為97.7%, 依據(jù)上述定種原則, 該菌株也可能是色桿菌屬內(nèi)的一個(gè)潛在新種。

分布于 γ-Proteobacteria的菌株主要包括交替單胞菌目(Alteromonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)。其中菌株R-4-R-4與分離自俄羅斯西伯利亞凍土的鹽晶嗜冷桿菌Psychrobacter cryohalolentis的16S rRNA基因序列近乎相同(99.9%)[9]； 菌株R-3-M-11同分離自韓國(guó)南海海水的快生嗜冷桿菌Psychrobacter celer[10]的16S rRNA基因序列相似性為 99.2%； 菌株 R-2-H-2-1同分離自韓國(guó)濟(jì)州島黑沙灘的玄武巖希瓦氏菌Shewanella basaltis的16S rRNA基因序列相似性為99.1%； 而菌株 R-2-M-13 同解脂海桿狀菌(Marinobacter lipolyticus)模式菌株的16S rRNA基因序列相似性為 97.9%[11], 亦可初步判定可能為海桿狀菌屬內(nèi)的一個(gè)潛在新種。

表1 俄羅斯庫(kù)頁(yè)島潮間帶沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌的分布Tab.1 Distribution of culturable bacteria isolated from intertidal sediments samples of Russian Sakhalin Island

圖1 變形細(xì)菌門(mén)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic relationships of culturable bacterial strains related to the Proteobacteria.

從圖 2和表 1看出, 有 9株菌分布于放線菌門(mén)(Actinobacteria)的放線菌綱(Actinobacteria C)。其中菌株 R-1-R-13-1與分離自韓國(guó)濟(jì)州島海水的海水微桿菌Microbacterium aquimaris的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近, 16S rRNA 基因序列近乎相同(99.9%)； 菌株R-3-M-4-1與分離自韓國(guó)東海阿穆?tīng)査箍藶澈Ｋ陌⒛聽(tīng)査箍藶雏}地桿菌Salinibacterium amurskyense的 16S rRNA基因序列也近乎相同(99.9%), 推測(cè)菌株 R-1-R-13-1和 R-3-M-4-1分別與M.aquimaris和S.amurskyense為同一物種或菌株。而菌株 R-4-M-5和 R-4-H-33與相似性最高的、分離自日本 Shinjiko湖泊近岸沉積物的湖泊微桿菌(M.lacus)和法國(guó)利摩日高鈾土壤的利摩日微桿菌(M. lemovicicum)[12]的 16S rRNA基因序列相似性分別為98.3%和98.1%, 推測(cè)有可能是微桿菌屬內(nèi)的2個(gè)潛在新種。剩余5株菌中, 除R-4-H-3與Demequina flavaHR08-7T的相似性為98.8%外, 其他菌株與最近標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性均大于98.3%。

圖2 擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic relationships of culturable bacterial strains related to Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes.

厚壁菌門(mén)(Firmicutes)細(xì)菌在近海和淺海沉積物中較為常見(jiàn)[13]。本研究表明, 分布于厚壁菌門(mén)的 9株菌均屬于桿菌綱(Bacilli)。其中菌株 R-1-R-2A與分離自韓國(guó)黃海的 Daepo海灘灘涂的海微小桿菌Exiguobacterium marinum的16S rRNA基因序列幾乎相同(99.9%)； 菌株R-1-R-7-1和R-4-H-7同分離自韓國(guó)黃海灘涂的近海游動(dòng)球菌Planococcus maritimus系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近(相似性分別是 99.64%, 99.58%)；菌株R-1-R-11同分離自韓國(guó)東海Hwajinpo海灘海水的花津?yàn)┭挎邨U菌(Bacillus hwajinpoensis)的 16S rRNA基因序列相似性為99.6%[14]。

擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)細(xì)菌在海洋中分布也十分廣泛, 并且在很多水體和海洋沉積物中有較高的豐度, 很多擬桿菌能產(chǎn)生各種各樣的胞外水解酶,經(jīng)常與藻類形成共生關(guān)系, 還可以在大型海洋生物表面或內(nèi)部生長(zhǎng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)共有 8個(gè)菌株屬于擬桿菌門(mén), 其中R-3-M-5-2屬于圓桿菌科(Cyclobacteriaceae)的食冷菌屬(Algoriphagus), 它同分離自日本海綠藻Acrosiphonia sonderi的維氏嗜冷菌Algoriphagus winogradskyi[16]的16S rRNA基因序列相似性為100%, 可能為同一菌株。其余7株菌均屬于黃桿菌科(Flavobacteriaceae), 其中菌株 R-1-M-5A同分離自日本海紅藻(Polysiphonia japonica)的多管藻海狀桿菌(Maribacter polysiphoniae)[17]的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近, 16S rRNA基因序列相似性為99.9%； 菌株 R-4-R-7同分離自日本海海水樣品的居水海菌(Maribacter aquivivus)的16S rRNA基因序列相似性為99.4%； 菌株R-3-M-8同分離自韓國(guó)褐藻的水域華美菌(Formosa undariae)的16S rRNA基因序列相似性為 99.2%； 菌株 R-1-R-2同分離自日本海 Troitsa灣海膽(Strongylocentrotus intermedius)的米氏海藻桿菌(Algibacter mikhailovii)的16S rRNA基因序列相似性為99.6%； 而菌株R-2-R-3-1同分離自韓國(guó)Gangjin灣海水的港津極地桿菌(Polaribacter gangjinensis)的16S rRNA基因序列的相似性只有94.2%, 依據(jù)現(xiàn)行國(guó)際細(xì)菌分類規(guī)則, 極有可能是不同于極地桿菌屬(Polaribacter)的一個(gè)潛在新屬。

3 討論

各種特殊生態(tài)環(huán)境是獲取微生物新種質(zhì)資源的有效途徑, 也是進(jìn)行微生物新型生物活性物質(zhì)研發(fā)的基礎(chǔ)。本研究采用常規(guī)2216E培養(yǎng)基以及R2A、M1兩種寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基, 首次對(duì)俄羅斯庫(kù)頁(yè)島潮間帶沉積物的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了分離, 并做了基于 16S rRNA基因序列分析的系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究。從培養(yǎng)分離效果來(lái)看, 常規(guī) 2216E培養(yǎng)基所分離菌株的多樣性要稍高于R2A和M1寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。從系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果來(lái)看, 所選擇的45株菌共分布于6個(gè)綱、27個(gè)屬、44個(gè)種。其中以變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群, 占45株代表菌株的 42.2%； 而分布于放線菌門(mén)(Actinobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)的細(xì)菌所占比例基本相當(dāng), 分別20.0%、20.0% 和 17.8%。這些菌株大部分與分離自日本和韓國(guó)近海的細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上非常接近,推測(cè)它們有可能是通過(guò)海水環(huán)流等因素在太平洋北部海域之間進(jìn)行擴(kuò)散所致。另外我們還從分離菌株中發(fā)現(xiàn)有 8株菌(R-1-H-3、R-4-M-3、R-1-R-9、R-2-R-1、R-1-M-4-1、R-2-M-13、R-4-M-5、R-4-H-33)與相應(yīng)關(guān)系最近的標(biāo)準(zhǔn)模式菌株的 16S rRNA基因序列相似度在97.3%～98.3%, 1個(gè)菌株(R-2-R-3-1)的相似度為 94.2%。按照以往國(guó)際細(xì)菌分類通用規(guī)則,16S rRNA基因序列相似度＜97.0%和＜95.0%分別是確定新種群與新屬的必要前提之一[18]。然而由于16S rRNA基因序列的局限性, 在某些特殊情況下(如菌株具有比較明顯的生理、生化、生態(tài)特征,DNA-DNA雜交結(jié)果與16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果互不相符等情況), 這一規(guī)則被人們進(jìn)行不同程度地重新考量[5-6]。綜合近些年IJSEM上發(fā)表的新種、屬文獻(xiàn), 并根據(jù)Mincheol Kim等人[19]2014年對(duì)細(xì)菌種間 16SrDNA序列相似性的最新研究標(biāo)準(zhǔn)(即 16S rRNA 基因序列相似度＜98.5%的菌株均具有成為新種的可能)。我們認(rèn)為上述8株菌有成為潛在新種的可能, 而菌株R-2-R-3-1也已滿足成為新屬的必要條件之一, 當(dāng)然這尚需DNA-DNA雜交、G+C mol%、生理生化表性特征等多項(xiàng)分類數(shù)據(jù)進(jìn)行相互印證后方可確定。本研究表明俄羅斯庫(kù)頁(yè)島潮間帶沉積物中細(xì)菌具有非常高的物種多樣性, 該結(jié)果可為進(jìn)一步研究海洋細(xì)菌的區(qū)域性生物地理學(xué)提供有益參考。

[1] 夏涵, 府偉靈, 陳鳴, 等. 快速提取細(xì)菌DNA方法的研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2005, 32(5)： 571-573.

[2] Ivanova E P, Zhukova N V, Lysenko A M, et al.Loktanella agnitasp. nov., andLoktanella roseasp.nov., from the north-west Pacific Ocean[J]. Int J Syst Evol Microbiol , 2005, 55： 2203 -2207.

[3] Yoon J H, Kang S J, Oh T K.Sulfitobacter marinussp.nov., isolated from seawater of the East Sea in Korea[J]. Int J Syst Evol Microbiol , 2007, 57： 302-305.

[4] Ivanova E P, Gorshkova N M, Sawabe T, et al.Sulfitobacter delicatussp. nov. andSulfitobacter dubiussp. nov., respectively from a starfish (Stellaster equestris) and sea grass (Zostera marina) [J]. Int J Syst Evol Microbiol , 2004, 54, 475-480.

[5] Stackebrandt E, Goebel B M. Taxonomic note： A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology[J]. International Journal of Systematic Bacteriology. 1994, 44： 846-849.

[6] Jae-Chang Cho, James M. Tiedje. Bacterial species determination from DNA-DNA hybridization by using genome fragments and DNA microarrays [J]. Appl Environ Microbiol, 2001, 67(8)： 3677 -3682.

[7] Shiba T, U Simidu.Erythrobacter longusgen. nov., sp.nov., an aerobic bacterium which contains acteriochlorophylla[J]. Int J Syst Bacteriol, 1982, 32： 211-217.

[8] Yoon J H, Oh T K , Park Y H.Erythrobacter seohaensissp. nov. andErythrobacter gaetbulisp. nov.,isolated from a tidal flat of the Yellow Sea in Korea[J]. Int J Syst Evol Microbiol , 2005a, 55： 71 -75.

[9] Bakermans C, Ayala-del-Rio H L, Ponder M A, et al.Psychrobacter cryohalolentissp. nov. andPsychrobacter arcticussp. nov., isolated from Siberian permafrost[J].Int J Syst Evol Microbiol, 2006, 56： 1285 -1291.

[10] Yoon J H, Lee C H, Kang S J , Oh T K.Psychrobacter celersp. nov., isolated from sea water of the South Sea in Korea [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2005b, 55： 1885 -1890.[11] Martín S, Marquez M C, Sánchez-Porro C, et al.Marinobacter lipolyticussp. nov., a novel moderate halophile with lipolytic activity [J]. Int J Syst Evol Microbiol , 2003, 53： 1383-1387.

[12] Mondani L, Piette L, Christen R., Bachar D,Berthomieu C and Chapon V. Microbacterium lemovicicum sp. nov., a bacterium isolated from a natural uranium-rich soil [J]. Int J Syst Evol Microbiol,2013, 63： 2600 -2606.

[13] 劉欣, 肖天, 張文燕, 等. 膠州灣海域表層沉積物細(xì)菌多樣性[J].海洋科學(xué), 2010, 4(10)： 1-6.

[14] Yoon J H, Kim I G, Kang K H, et al.Bacillus hwajinpoensissp. nov. and an unnamedBacillusgenomospecies, novel members ofBacillusrRNA group 6 isolated from sea water of the East Sea and the Yellow Sea in Korea[J]. Int J Syst Evol Microbiol ,2004, 54： 803-808.

[15] Grossart H P and Ploug H. Microbial degradation of organic carbon and nitrogen on diatom aggregates [J].Limnology and oceanography, 2001, 46 (2)： 267 -277.

[16] Nedashkovskaya O I, Vancanneyt M, Van Trappen S, et al. Description ofAlgoriphagus aquimarinussp. nov.,Algoriphaguschordaesp. nov. andAlgoriphagus winogradskyisp. nov., from sea water and algae,transfer ofHongiella halophilaYi and Chun 2004 to the genusAlgoriphagusasAlgoriphagus halophiluscomb.nov. and emended descriptions of the generaAlgoriphagusBowmanet al.2003 andHongiellaYi and Chun 2004 [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2004, 54：1757-1764.

[17] Nedashkovskaya O I, Vancanneyt M, De Vos P, et al.Maribacter polysiphoniaesp. nov., isolated from a red alga[J]. Int J Syst Evol Microbiol , 2007, 57：2840-2843.

[18] Stackebrandt E, Boebel B M. Taxonomic Note： A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA Sequence analysis in the present species definition in bacteriology[J]. Int J Syst Bacteriol, 1994, 44： 846-849.

[19] Mincheol Kim, Hyun-Seok Oh, Sang-Cheol Park , et al.Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2014, 64： 346-351.