胡萬(wàn)銀

摘 ? ?要：本試驗(yàn)以報(bào)春花葉片、莖段作為外植體，進(jìn)行了初代組織培養(yǎng)，并進(jìn)行增殖、生根培養(yǎng)。結(jié)果表明：75%的酒精（0.5 min）+0.1%升汞（8 min）具有很好的消毒作用;MS +6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1是不定芽分化的最佳培養(yǎng)基配比;MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA 0.2 mg·L-1是不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基配比;1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1是生根的最佳培養(yǎng)基配比。

關(guān)鍵詞：報(bào)春花;外植體;培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：S688 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.036

Tissue Culture of Primula malacoides Franch.

HU Wan-yin

（Tree Breeding Research Center of Shanxi Province，Taiyuan， Shanxi 030006 ， China）

Abstract： In this experiment， leaves and stems of Primula malacoides Franch. were taken as explants， and conducted the primary tissue culture， and proliferation， rooting culture. The results showed that 75% alcohol （0.5 min） 0.1% mercuric chloride （8 min） had good disinfection effect; the best medium ratio for the differentiation of adventitious buds was MS +6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA 0.2 mg·L-1; for adventitious bud proliferation， the optimum culture medium composition was MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA 0.2 mg·L-1; 1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1 was the best rooting culture medium composition.

Key words： Primula malacoides Franch.; explants; callus culture medium

報(bào)春花 （Primula malacoides Franch.）又名小種櫻草、七重樓，報(bào)春花科報(bào)春花屬，葉片長(zhǎng)卵形或圓形，葉緣有齒，葉柄長(zhǎng)5 cm左右。花葶高20～30 cm，花冠高腳碟狀。多生長(zhǎng)于荒野、田邊，原產(chǎn)于中國(guó)的云南、貴州，各地栽培，頗具觀賞性。

報(bào)春花原產(chǎn)中國(guó)，草本植物。喜氣候溫涼、濕潤(rùn)的環(huán)境和排水良好、富含腐殖質(zhì)的土壤，不耐高溫和強(qiáng)烈的直射陽(yáng)光，多數(shù)亦不耐嚴(yán)寒。葉基生，全株被白色絨毛?；ㄍǔ?型，排成傘形花序或頭狀花序?；ㄆ跒?2月至次年4月，早春開(kāi)花為本屬植物的重要特性，其中文名報(bào)春和學(xué)名均含有早花的意思。近年來(lái)發(fā)展很快，已成為當(dāng)前一類重要的園林花卉。

組織培養(yǎng)又叫離體培養(yǎng)，通常指從植物體中分離出符合需求的組織（器官、細(xì)胞、原生質(zhì)體等），在人工無(wú)菌操作條件下，進(jìn)行培養(yǎng)從而獲得再生的完整植株，或者生產(chǎn)出具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。本試驗(yàn)以報(bào)春花葉片、莖段為外植體，進(jìn)行了初代組織培養(yǎng)，并進(jìn)行增殖、生根培養(yǎng)，在建立報(bào)春花組織培養(yǎng)無(wú)菌體系的基礎(chǔ)上，對(duì)比了外植體不同滅菌方法對(duì)滅菌效果的影響，以及不同激素濃度對(duì)報(bào)春花葉片、莖段芽分化、不定芽增殖及其生根的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

使用材料取自盆栽報(bào)春花的葉片和莖段。

1.2 試驗(yàn)材料的處理

組織培養(yǎng)前，先從室內(nèi)培養(yǎng)的盆栽植株上取生長(zhǎng)旺盛的報(bào)春花葉片和嫩莖作外植體，取材后放入燒杯里，用大量的水洗去表面附著物后，再放到自來(lái)水管下進(jìn)行二次沖洗（時(shí)間約60 min），然后放入到瓶中，在超凈工作臺(tái)上再迅速用無(wú)菌蒸餾水沖洗3遍后等分為2份。每種消毒劑處理15瓶，每瓶接種4塊，處理方法見(jiàn)表1。最后，用無(wú)菌蒸餾水沖洗6次。將葉片橫切和縱切后切成1 cm×1 cm大小，將嫩莖切成1 cm左右的莖段作外植體用。

1.3 培養(yǎng)基配比

基本培養(yǎng)基為MS，瓊脂為6 g，蔗糖濃度為3%，pH 值為5.8。初代培養(yǎng)基為：（1）MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（2）MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1;（3）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（4）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1;（5）MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（6）MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。增殖培養(yǎng)基為：（7）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（8）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。生根培養(yǎng)基為：（9）1/2MS+NAA ?0.1 mg·L-1;（10）1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1。培養(yǎng)室內(nèi)溫度為（25±2） ℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，每天光照12 h，補(bǔ)光燈在光照不夠的條件下及時(shí)補(bǔ)光。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑處理的消毒效果

進(jìn)行初代培養(yǎng)10 d后對(duì)120瓶培養(yǎng)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。處理Ⅰ、處理Ⅱ的消毒效果差異明顯，處理Ⅱ的消毒效果是處理Ⅰ的17倍，因此單獨(dú)使用酒精對(duì)報(bào)春花外植體進(jìn)行消毒處理，污染率高，效果不太好;而用70%酒精（0.6 min）+0.1%HgCl2（10 min）對(duì)報(bào)春花外植體消毒效果明顯。

2.2 不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的時(shí)間

經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)10 d后，對(duì)每種培養(yǎng)基中莖段和葉片愈傷組織形成情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從表3可看出，由于培養(yǎng)基配比不同，如果培養(yǎng)基配比合適，報(bào)春花葉片在第11天就可以形成愈傷組織，而莖段需要在第15天左右才能形成，其誘導(dǎo)時(shí)間比用葉片作為外植體的時(shí)間要長(zhǎng)約4 d左右。

2.3 激素對(duì)初代培養(yǎng)的影響

將經(jīng)過(guò)消毒組合Ⅱ處理好的外植體接種到初代培養(yǎng)基1～6，培養(yǎng)11 d后，大部分葉片的切塊邊緣首先開(kāi)始膨大，長(zhǎng)出淡綠色的愈傷組織，并呈疏松的顆粒狀，有部分葉片在切口處直接產(chǎn)生不定芽;接種20 d后愈傷組織表面出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，開(kāi)始分化出0.2～0.5 cm的不定芽，35 d后頂芽萌動(dòng)并長(zhǎng)出側(cè)芽和分枝。

表4是第36天出芽的外植體統(tǒng)計(jì)數(shù)，激素的影響由表4中可以看出。在培養(yǎng)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA 2.0 mg·L-1、NAA0.1 mg·L-1時(shí)，在后期出現(xiàn)部分芽苗玻璃化、失綠現(xiàn)象;當(dāng)NAA 0.2 mg·L-1、6-BA 2.0 mg·L-1時(shí)，分化出的不定芽形態(tài)明顯弱小;當(dāng)6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率較高，而且芽苗生長(zhǎng)健壯，芽苗利用率也好。因此，初代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基配比為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

2.4 激素對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

將初代培養(yǎng)得到的芽叢和分枝切割成帶1～2個(gè)節(jié)的小段，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基7～8上，約15 d后，就可以不斷長(zhǎng)出大量的芽和分枝，培養(yǎng)基7和8中的芽都有增殖，但是培養(yǎng)基配比8的效果好，分化叢生芽芽體健壯，數(shù)量多，長(zhǎng)勢(shì)良好，適合葉、莖段的繼代培養(yǎng)。當(dāng)NAA為0.1 mg·L-1時(shí)，有部分芽生長(zhǎng)良好，但部分芽體長(zhǎng)勢(shì)較略差，長(zhǎng)不高，影響叢生芽的大量繼代增殖（表5）。

2.5 激素對(duì)生根培養(yǎng)的影響

切取分化增殖所得到的高約2～3 cm生長(zhǎng)健壯的叢生芽苗，將分枝切成帶有2個(gè)節(jié)的莖段，轉(zhuǎn)接種到添加不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基9～10中。在生根培養(yǎng)進(jìn)行到第30天的時(shí)候，對(duì)叢生芽的生根情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表6。

當(dāng)在1/2MS基本培養(yǎng)基中添加NAA濃度為0.1 mg·L-1（培養(yǎng)基9）時(shí)，生根率為85.0%，平均生根數(shù)達(dá)到12.6條，根長(zhǎng)為1. 0 cm左右。當(dāng)添加NAA濃度為0.2 mg·L-1（培養(yǎng)基10）后，誘導(dǎo)的叢生芽生根率升高，達(dá)到97.5%，平均生根數(shù)有13.8條左右，并且根粗壯，苗長(zhǎng)勢(shì)良好，根長(zhǎng)為1.4 cm左右。

3 結(jié)論與討論

由于報(bào)春花葉片肉質(zhì)光滑，易于表面滅菌消毒，無(wú)菌操作簡(jiǎn)單，切割過(guò)程也容易操作，瓶苗移栽后管理較粗放，組培繁殖極易見(jiàn)效率，經(jīng)濟(jì)效益亦是可觀的。

因?yàn)橹参矬w表面常附有各種各樣的微生物，無(wú)菌操作過(guò)程中，對(duì)于植物材料表面的消毒尤為重要，因?yàn)橐坏нM(jìn)培養(yǎng)基，微生物就會(huì)迅速滋生造成植物材料死亡。75%酒精（0.5 min）+0.1%HgCl2（8 min）的消毒處理有更強(qiáng)的殺菌能力和穿透力，而且有濕潤(rùn)作用，對(duì)報(bào)春花葉片和莖段的消毒處理效果明顯。

植物激素的種類和配比，是使植物組織分化出苗和快速增殖的重要因素，通過(guò)此次不同梯度培養(yǎng)基配比，發(fā)現(xiàn)雖然都能使植物分化出苗和增殖，但是低濃度和高濃度的激素配比使植物分化出苗較慢，同時(shí)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素比例過(guò)高，導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生，其中MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1激素配比最佳，利于報(bào)春花愈傷組織的生長(zhǎng)和分化，進(jìn)行初代培養(yǎng);MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1是最有利于增殖的培養(yǎng)基;最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1。

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