孫榅淑，王俊，周駿，馬雁軍，白若石，楊惠娟，許東亞，焦哲恒，史宏志

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450002；2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠，北京100024

硝態(tài)氮含量對(duì)煙葉高溫貯藏過(guò)程中TSNA形成的影響

孫榅淑1，王俊1，周駿2，馬雁軍2，白若石2，楊惠娟1，許東亞1，焦哲恒1，史宏志

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450002；2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠，北京100024

為研究硝態(tài)氮含量對(duì)調(diào)制后煙葉高溫貯藏過(guò)程中TSNA形成的影響，設(shè)計(jì)白肋煙田間施氮肥量試驗(yàn)、室內(nèi)對(duì)烤煙煙葉添加不同濃度硝酸鹽試驗(yàn)，并對(duì)白肋煙和烤煙的葉片和煙梗分別取樣，得到硝態(tài)氮含量差異較大樣品。將樣品在高溫（45℃）條件下貯藏15 d，以在低溫（10℃）條件下貯藏作為對(duì)照，測(cè)定所有樣品的硝態(tài)氮和TSNA含量。結(jié)果表明：煙葉中硝態(tài)氮含量與施氮量呈正相關(guān)；新調(diào)制的煙葉硝態(tài)氮含量與TSNAs相關(guān)性較小，在高溫貯藏15 d后，其相關(guān)性顯著增加，煙葉硝態(tài)氮含量與高溫貯藏期間TSNAs的增加量呈顯著正相關(guān)；白肋煙和烤煙均表現(xiàn)出煙葉主脈中的硝態(tài)氮含量遠(yuǎn)高于葉片，高溫貯藏15 d后，主脈TSNA增加量顯著高于葉片；在人工添加硝酸鹽的試驗(yàn)中，隨添加硝酸鹽量的增加，烤煙煙葉硝態(tài)氮含量及高溫貯藏后TSNA含量顯著增加。以上說(shuō)明硝態(tài)氮含量與高溫貯藏過(guò)程中TSNAs的形成有密切關(guān)系，通過(guò)農(nóng)業(yè)措施降低煙葉硝態(tài)氮積累是減少貯藏過(guò)程中TSNA形成的有效途徑。

煙草；硝態(tài)氮；TSNAs；高溫；貯藏

煙草特有亞硝胺( Tobacco Speci fi c N-nitrosamines,TSNAs )是由煙草生物堿發(fā)生亞硝化作用生成的存在于煙葉和煙氣中的有害成分。有關(guān)TSNAs的致病機(jī)制在國(guó)內(nèi)外已有大量報(bào)道，其有害性在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[1-2]。目前已鑒定出煙草中8種特有的亞硝胺[3]。其中，在煙葉和煙氣中含量較高且在近年來(lái)研究較多的煙草特有亞硝胺有4種：N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、4-(N-甲基-亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)和N-亞硝基假木賊堿(NAB)[4]。許多研究表明，進(jìn)入調(diào)制前的鮮煙不含TSNAs或含量極低[5-6]，煙葉中的TSNAs主要在調(diào)制和貯藏過(guò)程中形成和積累，但目前研究多集中在煙葉調(diào)制期間TSNAs的形成。Burton[7]和Cui[8]等的研究表明，白肋煙和晾曬煙的TSNAs快速增長(zhǎng)發(fā)生在調(diào)制過(guò)程煙葉的變黃末期，在調(diào)制的第4到第7周含量大幅提高。

白肋煙調(diào)制結(jié)束后的貯藏階段也是TSNA形成的重要時(shí)期，煙葉貯藏階段其TSNA含量比調(diào)制結(jié)束可提高50%以上。De Roton等[9]報(bào)道貯藏在環(huán)境溫度下的白肋煙粉碎樣品，6個(gè)月后TSNA含量由1.3～1.4 μg/g增加到8.1～9.5 μg/g，而貯藏在冰箱里的樣品TSNA含量沒(méi)有顯著增加。Saito等[10]也報(bào)道隨著溫度的增加，白肋煙貯藏?zé)熑~TSNA含量和氮氧化物含量大幅增高。前期研究表明，不同類型煙葉貯藏過(guò)程中TSNA形成和積累有顯著差異，在高溫貯藏過(guò)程中，硝態(tài)氮含量較高的白肋煙TSNA形成量遠(yuǎn)大于含量低的烤煙[11]，為進(jìn)一步研究煙草硝態(tài)氮含量對(duì)高溫貯藏過(guò)程中TSNA形成的影響，設(shè)置了白肋煙不同施氮量田間試驗(yàn)，以獲得不同硝態(tài)氮含量的白肋煙。在另一個(gè)試驗(yàn)中，通過(guò)向烤煙煙葉中人為添加不同濃度的硝酸鹽，得到不同硝態(tài)氮含量的烤煙煙葉。將樣品進(jìn)行高溫貯藏以研究硝態(tài)氮與貯藏過(guò)程中TSNA形成的關(guān)系。煙葉的葉片和煙梗在化學(xué)組成上差異很大，與調(diào)制后煙葉的葉片相比，葉梗的香氣物質(zhì)、生物堿含量較低，但硝態(tài)氮含量和TSNA積累量顯著高于葉片。試驗(yàn)中還以硝態(tài)氮和生物堿含量差異較大的煙葉葉片和煙梗為材料在高溫下貯藏研究其TSNA形成的差異性。該研究旨在揭示貯藏過(guò)程中煙草特有亞硝胺形成機(jī)理，為通過(guò)農(nóng)藝和控制貯藏環(huán)境減少和抑制TSNA形成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 地點(diǎn)和材料

白肋煙樣品的產(chǎn)地為云南賓川，品種為T(mén)N86，烤煙樣品的產(chǎn)地為河南許昌，品種為中煙100，所取樣品均為上二棚煙葉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同施氮量水平的白肋煙樣品

在云南賓川白肋煙產(chǎn)區(qū)進(jìn)行田間試驗(yàn)，土壤為壤土，中等肥力，土壤pH為6.23，有機(jī)質(zhì)含量為22.8 g/kg，堿解氮含量為50.2 mg/kg，速效磷含量為12.4 mg/kg，速效鉀含量為54.1 mg/kg。試驗(yàn)共設(shè)四個(gè)施氮量，分別為：120，180，240，300 kg/hm2，其中75%的氮源為硝態(tài)氮。試驗(yàn)為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次。

1.2.2 不同類型煙葉煙梗樣品

白肋煙和烤煙分別取自云南賓川與河南許昌，栽培與調(diào)制按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方式進(jìn)行。分別以白肋煙和烤煙的煙葉和煙梗為供試材料，取樣后，將葉片與葉梗分開(kāi)，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.3 添加不同濃度硝酸鈉的烤煙樣品

以河南許昌烤煙煙葉為供試材料，將煙葉去除主脈后，剪成0.5 cm2大小的碎片，稱取6份等量的20 g。其中5份待進(jìn)行高溫貯藏的煙葉分別均勻噴施10 mL濃度為0.00、0.01、0.02、0.03、0.04 g/mL的NaNO3溶液，另外1份待進(jìn)行低溫貯藏的煙葉噴10 mL蒸餾水。之后將煙葉置于10℃、RH 60%的恒溫恒濕箱中平衡水分。

1.2.4 樣品高溫貯藏

將不同施氮量水平的白肋煙和不同類型煙葉煙梗的每個(gè)樣品稱取兩份等量的20 g。一份置于恒定的45℃、RH 60%的恒溫恒濕箱內(nèi)處理15 d，一份置于恒定的10℃、RH 60%環(huán)境下貯藏15 d作為對(duì)照。將添加不同濃度硝酸鈉溶液的烤煙置于45℃、RH 60%的恒溫恒濕箱內(nèi)處理15 d，低溫對(duì)照置于恒定的10℃、RH 60%環(huán)境下貯藏15 d。之后將所有樣品冷凍干燥，磨碎后過(guò)60目篩。

1.3 化學(xué)成分含量測(cè)定

1.3.1 硝態(tài)氮含量測(cè)定：煙葉樣品送至美國(guó)肯塔基大學(xué)煙草化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)定，采用比色法,具體參數(shù)按Burton等[12]方法進(jìn)行。

1.3.2 TSNA含量測(cè)定：所有樣品送至美國(guó)肯塔基大學(xué)和上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，美國(guó)肯塔基大學(xué)測(cè)定方法為氣相色譜-熱能分析聯(lián)用儀(TEA)，具體參數(shù)按Burton等[7,12]方法進(jìn)行。北京卷煙廠測(cè)定方法為在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（SPELC-MS/MS）法[13]，即將煙樣全自動(dòng)固相萃取，萃取液過(guò)水相濾膜后使用LC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫處理下不同施氮量白肋煙中TSNAs及硝態(tài)氮含量的變化

表1的結(jié)果表明，隨著施氮量增加，產(chǎn)量有不同程度的增加，隨著施肥量從120 kg/hm2增加到240 kg/hm2，產(chǎn)量從2085 kg/hm2增加到了3279 kg/hm2，施肥量繼續(xù)增加時(shí)，產(chǎn)量的增加量減小。10℃貯藏15 d煙葉硝態(tài)氮含量隨著施肥量和產(chǎn)量的增加而顯著增加，TSNA含量隨硝態(tài)氮增加而呈增加的趨勢(shì)，但相關(guān)性較差。然而，在45℃條件下貯藏15 d的煙葉，隨著硝態(tài)氮含量增加，TSNA含量顯著增加，不同施氮肥量的煙葉與低溫對(duì)照的差異均達(dá)到極顯著水平，與對(duì)照相比TSNAs的凈增加量隨著硝態(tài)氮含量的增加而更多地增加，且呈顯著高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.98。這一結(jié)果表明，煙草中的硝態(tài)氮水平與煙葉高溫條件下貯藏過(guò)程中TSNAs的形成密切相關(guān)。

2.2 高溫處理下不同類型煙葉煙梗中TSNAs及硝態(tài)氮含量的變化

表2結(jié)果表明，無(wú)論白肋煙還是烤煙，相同溫度下煙梗的硝態(tài)氮含量都顯著高于葉片。經(jīng)過(guò)高溫處理后，葉片和葉梗TSNA含量均顯著增加，高溫處理后的TSNA總量與低溫對(duì)照相比差異均達(dá)到極顯著水平。但葉梗中TSNAs的增加量顯著高于葉片中的增加，其中白肋煙煙梗的TSNAs增加95.80%，而葉片增加106.66%；烤煙煙梗的差異更為明顯，烤煙煙梗高溫處理后增加367.05%，而葉片增加77.70%。

TSNAs的前體物為生物堿和硝酸鹽，在對(duì)高溫處理下不同類型煙葉煙梗中TSNAs及硝態(tài)氮含量變化的研究中，已知煙梗中的生物堿含量遠(yuǎn)低于煙葉中的含量，但硝態(tài)氮含量高于煙葉中的含量，高溫處理后煙梗TSNA增加量顯著大于葉片，說(shuō)明煙梗中較高的硝態(tài)氮含量與貯藏過(guò)程中TSNA形成的關(guān)系密切。

表1 高溫處理下不同施氮量煙葉TSNAs及硝態(tài)氮含量的變化Tab.1 Changes of TSNAs and nitrate nitrogen contents in tobacco leaves with different nitrogen applying amount under high temperature treatment μg·g-1

表2 高溫處理下白肋煙和烤煙煙梗中TSNAs及硝態(tài)氮含量的變化Tab.2 Changes of TSNAs and nitrate nitrogen contents in lamina and midrib of burley and fl ue-cured tobacco under high temperature treatment μg·g-1

2.3 人工添加硝酸鹽對(duì)烤煙貯藏過(guò)程中TSNA形成的影響

結(jié)果表明，隨著人工添加硝酸鹽量的增加，煙葉硝態(tài)氮含量顯著增加。在高溫貯藏條件下，煙 葉 NNK、NNN、NAT、NAB和 總 TSNA含 量均顯著高于低溫貯藏的對(duì)照樣品，且與添加硝酸鹽的量呈極顯著的高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.96,0.94,0.99,0.98,0.97。表明煙葉硝態(tài)氮含量對(duì)高溫貯藏中TSNAs的形成有重要影響。

圖1 烤煙添加硝酸鹽對(duì)高溫處理下硝態(tài)氮和TSNA含量的影響Fig. 1 Effect of adding nitrate to fl ue-cured tobacco on nitric nitrogen and TSNA content under high-temperature treatment

3 討論

煙草中硝態(tài)氮的積累與施肥、產(chǎn)量水平等密切相關(guān)，氮素作為煙草主要的營(yíng)養(yǎng)元素，不僅在煙株的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用，也是硝酸鹽、亞硝酸鹽及生物堿形成和積累的重要來(lái)源。硝態(tài)氮與調(diào)制后煙葉TSNA形成有密切關(guān)系[14]，在煙葉調(diào)制期間，普遍認(rèn)為T(mén)SNAs的形成主要是由于微生物的作用[15-17]，調(diào)制期間葉片表面的濕度與微生物活性在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。一般認(rèn)為，在調(diào)制過(guò)程中, 煙草中的硝酸鹽被微生物還原為亞硝酸鹽以及氮氧化物(NOx),然后與煙草生物堿作用形成TSNAs[3,6,18-20]。本試驗(yàn)表明，在煙葉高溫貯藏過(guò)程中，煙葉中的TSNA含量大量增加。在貯藏階段，環(huán)境相對(duì)濕度為60%，煙葉的相對(duì)含水率為17%，煙葉表面相對(duì)濕度較小，微生物活性低，因此可以推斷在這一階段煙葉硝態(tài)氮含量和溫度與TSNA含量的關(guān)系更為密切。王瑞云等[21]的研究發(fā)現(xiàn)不同類型煙草貯藏過(guò)程中 TSNA 形成對(duì)高溫的反應(yīng)差異較大，硝態(tài)氮含量低的烤煙在高溫處理后TSNAs 增加不顯著，而硝態(tài)氮含量高的白肋煙和曬煙增加幅度較大，因此認(rèn)為可能與不同類型煙草硝態(tài)氮含量有密切關(guān)系。本研究通過(guò)設(shè)置田間施氮量試驗(yàn)和在室內(nèi)人工添加硝酸鹽試驗(yàn)，并分別對(duì)硝酸鹽含量和生物堿含量差異較大的葉片和主脈取樣，直接證明了煙葉硝態(tài)氮含量對(duì)高溫貯藏過(guò)程中TSNAs的形成有重要影響，較高的硝態(tài)氮含量和高溫互作可能是造成貯藏期間TSNA含量增高的主要原因。

TSNAs主要是在煙葉中形成的，在卷煙燃燒過(guò)程中，煙葉中的TSNAs可直接傳輸?shù)綗煔庵校紵^(guò)程本身形成的TSNAs較少[22]，因此降低煙氣中的TSNAs應(yīng)主要從減少煙葉中TSNAs的形成和積累入手。煙氣中焦油含量與TSNA含量無(wú)顯著相關(guān)性，因而通過(guò)工業(yè)措施降低焦油后，TSNA含量不一定同步下降，而通過(guò)農(nóng)業(yè)措施降低煙葉中的TSNA含量有更大的可行性。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，控制和減少煙葉硝態(tài)氮積累對(duì)降低TSNAs有重要作用。硝態(tài)氮含量主要受氮肥種類及用量、土壤供肥特性、品種對(duì)氮素利用效率和利用模式等因素的綜合影響，因此，采取積極措施，通過(guò)調(diào)整施肥量和肥料種類等方法降低煙葉硝態(tài)氮積累，減少亞硝化反應(yīng)底物，是降低煙葉TSNA含量的一種重要途徑。

4 結(jié)論

白肋煙硝態(tài)氮的積累隨著施氮肥量的增加而增加，隨著人工添加硝酸鹽量的增加，烤煙煙葉硝態(tài)氮含量顯著增加，白肋煙和烤煙均表現(xiàn)出葉脈中的硝態(tài)氮含量遠(yuǎn)高于葉片。3項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均表明，隨著煙草硝態(tài)氮含量的增大，高溫貯藏過(guò)程中TSNA形成增多，煙葉硝態(tài)氮含量與高溫貯藏期間TSNAs的增加量呈顯著正相關(guān)。

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Effect of nitrate nitrogen level in tobacco leaves on TSNAs formation during high temperature storage

SUN Wenshu1, WANG Jun1, ZHOU Jun2, MA Yanjun2, BAI Ruoshi2, YANG Huijuan1, XU Dongya1, JIAO Zheheng1, SHI Hongzhi1
1 National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Tobacco Cultivation Key Laboratory of China Tobacco, Zhengzhou 450002, China;2 Beijing Cigarette Factory, Beijing 100024, China

Field experiment was conducted to determine the effect of nitrate nitrogen content on TSNAs formation during high temperature storage. Different concentration of nitrate was applied in tobacco growing season. Leaf samples from lamina and midrib of both burley and fl ue-cured tobacco were collected. Lab experiment was conducted in a temperature-controlled chamber at 45℃ and 10℃ for 15d. Nitrate nitrogen and TSNA contents of all samples were determined. Results indicated that nitrate nitrogen content increased with the increment of nitrogen fertilizer. Content of nitrate nitrogen and TNSA had a low correlation in newly cured tobacco. However, after high temperature storage for 15d, the correlation signi fi cantly increased. Nitrate nitrogen content and TSNAs increment during high temperature storage showed a signi fi cant positive correlation. Nitrate nitrogen content in midrib was much higher than that in lamina in both burley and fl uecured tobacco. After high temperature storage for 15d, TSNAs increment in midrib was significantly higher than that in lamina. With the increase of nitrate applied to fl ue-cured tobacco leaves, nitrate nitrogen and TSNA content after high temperature storage increased signi fi cantly. These results indicated that nitrate nitrogen content was closely related to the formation of TSNAs during high temperature storage. Therefore, reduction of leaf nitrate content through agronomic measures is effective in reducing TSNA formation during storage.

tobacco; nitrate nitrogen; tobacco-speci fi c nitrosamines; high temperature; storage

:SUN Wenshu, WANG Jun, ZHOU Jun, et al. Effect of nitrate nitrogen level in tobacco leaves on TSNAs formation during high temperature storage [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015,21 (2)

孫榅淑，王俊，周駿,等. 硝態(tài)氮含量對(duì)煙葉高溫貯藏過(guò)程中TSNA形成的影響 [J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2015,21（2）

國(guó)家煙草專賣局減害重大專項(xiàng)項(xiàng)目：110201301022（JH-03）

孫榅淑(1990—)，在讀碩士研究生，主要從事煙草栽培生理研究，Email：swssdd123@163.com

史宏志（1963—），博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事煙草栽培生理研究，Email：shihongzhi88@163.com

2014-01-07