劉華，劉可慧，周振明,，蘇銀萍，陳孟林,，陳朝述,，于方明,*

1. 廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西 桂林 541004；2. 桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境學(xué)院，廣西 桂林 541004；3. 廣西環(huán)境污染控制與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004

Mn、Zn單一及復(fù)合污染對水蓼氮素代謝的影響

劉華1，劉可慧2，周振明1,3，蘇銀萍1，陳孟林1,3，陳朝述1,3，于方明1,3*

1. 廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西 桂林 541004；2. 桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境學(xué)院，廣西 桂林 541004；3. 廣西環(huán)境污染控制與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004

采用水培的方法，研究了Mn、Zn單一及復(fù)合污染對錳超富集植物水蓼(Polygonum hydropiper L.)生長、氮代謝關(guān)鍵酶（谷氨酰胺合酶(GOGAT)、谷氨酸合成酶(GS)、硝酸還原酶(NR)、谷氨酸脫氫酶(GDH））活性以及硝態(tài)氮（NO3-）、銨態(tài)氮（NH4+）、可溶性蛋白質(zhì)、游離脯氨酸、葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量，水蓼對Mn、Zn的吸收和轉(zhuǎn)移系數(shù)的影響。研究結(jié)果表明，水蓼根、莖、葉中Mn、Zn含量，隨著Mn、Zn處理濃度的增加而增加，且水蓼對Zn和Mn的轉(zhuǎn)移系數(shù)分別維持在1.0～1.8和1.0～11.9，表明Zn對水蓼體內(nèi)Mn的轉(zhuǎn)移影響較為明顯；Mn/Zn單一及復(fù)合處理顯著降低了水蓼葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b的含量（P<0.05），但是葉綠素a/b較對照組顯著提高（P<0.05），Mn/Zn復(fù)合處理抑制了根系生長及株重，T8時(shí)，根長僅為對照組的64.93%，而T9時(shí)，株重僅為對照組的65.45%；單Zn及Mn/Zn復(fù)合處理均降低了水蓼根系中NO3-的含量，以及抑制NR活性，T5時(shí)，葉片和根中NR活性分別是對照組的44.36%和34.41%，但提高了葉片與根系中NH4+的含量，T9時(shí)葉片中的NH4+含量是對照組的2.35倍，T8時(shí)根中的NH4+含量是對照組的1.58倍，以及增加了GS活性，T9時(shí)，葉和根中GS活性分別使對照組的1.32和1.57倍，Zn及Mn、Zn復(fù)合處理對水蓼葉片與根系中可溶性蛋白質(zhì)含量無顯著影響（P>0.05），表明GS活性以及GDH活性提高在消除NH4+脅迫過程中起重要作用。

Mn/Zn復(fù)合污染；水蓼；氮素代謝

Mn和Zn作為動(dòng)植物生長所必須的營養(yǎng)元素，與300多種酶的活性有關(guān)，參與細(xì)胞的所有代謝過程，在維持動(dòng)植物生長中起著重要的作用（劉欣等，2005），Mn在植物光合作用中起著重要作用，但是高M(jìn)n將會抑制植物的光合作用，高含量的Mn抑制植物根系的伸長（臧小平，1999），Zn與植物的碳水化合物的轉(zhuǎn)化過程、光合作用密切相連，高Zn將抑制植物的生物量；高含量的Mn和Zn能抑制神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)，導(dǎo)致人體神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，引起帕金森綜合癥及頭暈、嘔吐、腹瀉等癥狀（曹永孝等，1993；Zhang等，2011）。廣西Mn礦含量豐富，開采量居全國之首位，但是大量的 Mn礦開采，導(dǎo)致礦區(qū)周圍Mn污染嚴(yán)重，同時(shí)還伴隨著中強(qiáng)度的Zn污染（黃芳芳，2011）。因此尋找適合本地的錳污染土壤修復(fù)治理的方法顯得尤為緊迫和必要。在眾多重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)中植物修復(fù)因其具有綠色環(huán)保和低成本的特點(diǎn)而倍受關(guān)注，并越來越多的應(yīng)用于污染土壤的修復(fù)（Liu等，2009；Abdolkarimc等，2011；Zhang等，2011）。

水蓼是國內(nèi)較早發(fā)現(xiàn)的Mn超富集植物之一，其對Mn具有較強(qiáng)的富集性、累積性和耐性，是一種良好的Mn污染土壤修復(fù)材料，在廣西也分布廣泛，但目前對其的研究主要集中在其對Mn的富集特征（王華等，2007）、Mn在植物體中的分布（王華等，2008）及Mn對抗氧化機(jī)理（于方明等，2011）的影響上。而重金屬復(fù)合污染對其生理特征的影響還未見報(bào)道。因此，本研究采用水培方式，探討了Mn、Zn及其交互作用對水蓼生長，Mn、Zn吸收，及氮素代謝途徑的影響，旨在為水蓼的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 植物培養(yǎng)

供試植物水蓼幼苗采自漓江沿岸。將所采集的水蓼幼苗用自來水沖洗干凈后采用1/2Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，Hoagland營養(yǎng)液組成為：2.0 mmol·L-1Ca(NO3)2.4H2O，0.10 mmol·L-1KH2PO4，0.50 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.10 mmol·L-1KCl，0.70 mmol·L-1K2SO4，0.10 μmol·L-1H3BO3，0.50 μmol·L-1MnSO4·H2O，0.50 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.20 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.01 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24，0.10 mmol·L-1Fe-EDTA。幼苗生長至一定高度后截取上端5 cm長的帶葉枝條進(jìn)行第2次預(yù)培養(yǎng)，待枝條長出比較旺盛的根系后，選取生長一致的植株，移至裝有 1/2 Hoagland營養(yǎng)液的黑色塑料盆（34 cm×22 cm ×11 cm，長×寬×高）中，然后加Mn處理，每盆種9株，培養(yǎng)溶液體積為4 L。采用正交法設(shè)置了3個(gè)不同濃度的Mn和Zn，共計(jì)9個(gè)處理濃度（見表1），其中Mn以MnSO4·H2O，Zn以ZnSO4·H2O的形式加入到1/2 Hoagland營養(yǎng)液中，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，營養(yǎng)液每3 d更換1次，并用0.1 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至5.7左右，培養(yǎng)室溫度為 20～25 ℃，空氣相對濕度為60%～70%，人工光照14 h，營養(yǎng)液保持24 h連續(xù)通氣，處理15 d后收獲。

表1 錳和鋅的處理濃度設(shè)置Table 1 Treated concentrations of Mn and Zn mg·L-1

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物量測定

將植株樣品用自來水沖洗凈，然后將根浸入20 mmol·L-1EDTA-Na2溶液中交換20 min，以去除根系表面吸附的Mn2+，最后用去離子水洗凈，吸水紙吸干表面水分，用卷尺分別測量株高和根長并稱鮮重。隨后將植物樣品的根和葉片分為兩部分，其中一部分裝入封口密封帶，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；另一部分植物樣品放至烘箱?nèi)，在 105 ℃下殺青30 min，然后在70 ℃下烘48 h至恒重，用不銹鋼粉碎機(jī)磨碎，過60目尼龍網(wǎng)篩用于Mn、Zn含量測定。

1.2.2 NR、GS、GDH和GOGAT酶測定

NR、GS、GDH的測定參照《現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的方法（中國科學(xué)院上海植物生理研究所，1999）。NR以1 h內(nèi)還原KNO3生成NO2-的μg表示酶活性，GS活性以1 h內(nèi)形成1 μmol γ-谷氨?；u肟酸的酶量作為1個(gè)酶活性單位，GDH活性以NADH μmol·min-1·g-1蛋白質(zhì)表示。GOGAT的測定參照Sánchez（Sánchez等，2004）的方法，以每分鐘反應(yīng)液減少1 μmol的NADH所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位。以上酶的提取和測定均在0～4 ℃條件下完成。

1.2.3 NO3-、NH4+、可溶性蛋白質(zhì)和游離脯氨酸和葉綠素含量測定

葉綠素、NO3-、NH4+和游離脯氨酸含量的測定參照王學(xué)奎（王學(xué)奎，2006）的方法，可溶性蛋白質(zhì)的含量參照含量測定Bradford（Bradford，1976）的方法測定，使用牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 Mn和Zn的測定

稱取0.50 g烘干且磨碎的水蓼樣品于100 mL三角瓶中，加入HNO3-HClO4（兩者體積比為4∶1），消煮至澄清，用去離子水定容后采用原子吸收分光光度計(jì)（日立180-80型）測定各植物樣品中Mn和Zn的含量。

1.2.5 轉(zhuǎn)移系數(shù)（transfer factor, TF）的計(jì)算

轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF）=地上部分所累積的重金屬含量(mg·kg-1)/根部所累積的重金屬含量(mg·kg-1)

以上所有測定至少重復(fù) 3次，所得數(shù)據(jù)用excel2003和SPSS 17.0軟件處理，應(yīng)用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 水蓼對Mn/Zn單一及復(fù)合污染的吸收累積及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)

如表2所示，當(dāng)Mn濃度一定時(shí)，根、莖、葉中Zn含量隨著Zn處理濃度的增加而增加，而Mn的含量則隨著Zn濃度的增加而降低。而Zn濃度一定時(shí)，根、莖、葉中Mn的的含量均隨著Mn濃度的增加而呈現(xiàn)上升的趨勢。Mn、Zn單一處理及交互作用下，水蓼對Zn的轉(zhuǎn)移系數(shù)影響不明顯，維持在1.0～1.8，而對Mn的轉(zhuǎn)移系數(shù)維持在1.0～11.9之間，表明Zn對Mn的轉(zhuǎn)移影響較為明顯。

2.2 Mn/Zn對水蓼生長和光合色素的影響

從表3中可以看出，在Mn、Zn單一及復(fù)合處理處理下，對水蓼影響最大的為根長和株重。100 mg·L-1Mn處理（T3）及Mn、Zn復(fù)合處理（T5，T6，T7，T8）均顯著降低了水蓼的株重和根長（P<0.05），表明Mn、Zn對水蓼的株重和根長最為明顯，對株高的影響均較小。與水蓼生物量相比，Mn/Zn單一及復(fù)合污染對水蓼光合色素的影響更為明顯。Mn/Zn單一及復(fù)合污染顯著抵制了水蓼的葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素a+b的含量（P<0.05）。葉綠素a/b維持在2.3～3.2之間，并以T1處理最低，說明復(fù)合污染對葉綠素b的影響更大。單Mn或者單Zn處理對水蓼類胡蘿卜素影響不顯著（P>0.05）。

表2 Mn、Zn單一及復(fù)合污染對水蓼的累積和轉(zhuǎn)移系數(shù)Table 2 Accumulation and transfer factors on Mn or Zn in the P. hydropiper L.

表3 Mn、Zn單一及復(fù)合污染對水蓼生長和葉光合色素的影響Table 3 Effects of Mn/Zn simple and combined pollution on plant growth and photosynthetic pigments of P. hydropiper L.

2.3 Mn、Zn單一及復(fù)合污染對水蓼NO3-、NH4+、游離脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)的影響

如表4所示，單Zn處理降低了水蓼葉片與根系中NO3-的含量，根系中NO3-的含量在10 mg·L-1的單Mn處理時(shí)，顯著高于100 mg·L-1處理，而葉片中卻最低。Mn、Zn復(fù)合處理降低了根系中NO3-含量，而100 mg·L-1的Mn、Zn復(fù)合處理葉片中NO3-的含量顯著高于其他處理（P<0.05）。Mn、Zn處理提高了葉片與根系中 NH4+的含量，在單 Zn、Mn處理下，葉片與根系中NH4+的含量隨著處理濃度的增加而增加。在Mn處理濃度一定時(shí)，根系中游離脯氨酸的含量隨著Zn處理濃度的增加而降低，而在葉片中則表現(xiàn)為在Zn處理濃度為10 mg·L-1時(shí)，含量最低。水蓼葉片與根系中可溶性蛋白質(zhì)含量在Mn、Zn單一及復(fù)合污染下，與對照間均無顯著性差異（P>0.05）。

表4 Mn/Zn復(fù)合污染對對水蓼NO3-、NH4+、游離脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)的影響Table 4 Effects of Mn/Zn simple and combined pollution on NO3-, NH4+, free proline and soluble protein on P. hydropiper L.

表5 Mn、Zn單一及復(fù)合污染對對水蓼氮代謝關(guān)鍵酶的影響Table 5 Effects of Mn/Zn simple and combined pollution on activities of key enzymes of nitrogen metabolism on P. hydropiper L.

2.4 Mn/Zn單一及復(fù)合污染對水蓼氮代謝關(guān)鍵酶的影響

從表5中可以看出，Mn、Zn添加降低了水蓼葉片和根系中GOGAT、NR活性。但Zn處理增加了根系中NR活性，且Zn處理濃度越高，活性越高，單Mn處理則降低了根系NR活性。Mn、Zn單一及復(fù)合處理顯著提高了葉片與根系中 GS活性。葉片中GDH的活性變化與葉片中的NO3-和游離脯氨酸的變化趨勢相似。低濃度的Mn/Zn復(fù)合污染可以提高GDH的活性，但高濃度（T9）的Mn/Zn處理嚴(yán)重的抵制了該酶的活性。

3 討論

葉綠素是光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量高低將直接影響植物光合作用的強(qiáng)弱及物質(zhì)合成速率的高低（寇士偉等，2011）。本研究結(jié)果表明，Mn、Zn單一及復(fù)合處理顯著抑制了水蓼葉綠素a、b和a+b的含量（P<0.05），葉綠素含量的降低將直接影響植物光合作用及物質(zhì)的合成，導(dǎo)致生物量的降低，水蓼在Mn、Zn處理下植物根系生長受到了抑制、株重顯著降低，這與葉綠素含量降低有直接的關(guān)系。該結(jié)果與劉萍對Pb和Cd復(fù)合污染下檸檬酸對龍葵生長的影響研究結(jié)果相似（劉萍等，2012）。葉綠素含量降低可能是因?yàn)镸n和Zn進(jìn)入植物組織中后，Mn、Zn與細(xì)胞膜上的蛋白體結(jié)合，導(dǎo)致基粒垛疊結(jié)構(gòu)解體，引起葉綠素的降解（于方明等，2008），另外，本研究中發(fā)現(xiàn)，水蓼根、莖、葉中Mn、Zn含量均隨著Mn、Zn處理濃度的增加而增加，植物組織中大量的Mn、Zn存在，有可能替代了植物色素中的 Mg，引起蛋白質(zhì)變性。這兩種原因?qū)⒆罱K導(dǎo)致水蓼光合作用受阻，影響水蓼物質(zhì)的合成，從而降低植物的生物量。

植物能夠從土壤中吸收的氮源主要有 NO3-和NH4+，但其的轉(zhuǎn)化主要通過NR及GOGAT、GS來完成，因此NR以及GOGAT、GS被稱為植物氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶。本研究結(jié)果表明，單Zn及Mn、Zn復(fù)合處理均降低了水蓼葉片與根系中NO3-的含量，此時(shí)，葉片與根系中NR活性NO3-的含量變化相似，都顯著低于對照，根系中NO3-含量較低可能是由于水蓼體中高濃的Mn、Zn抑制了NO3-的吸收，同時(shí)抑制了NR活性。本研究還發(fā)現(xiàn)，Mn、Zn處理提高了葉片與根系中NH4+的含量，在單Zn、Mn處理下，葉片與根系中NH4+的含量隨著處理濃度的增加而增加，表明Mn、Zn處理造成了水蓼NH4+的脅迫。此時(shí)植物可以通過提高 GOGAT/GS循環(huán)相關(guān)酶以及GDH活性來消除NH4+的脅迫，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果水蓼根系中GS活性以及GDH活性在Mn、Zn處理下得到不同程度的升高的結(jié)果一直，表明GS活性以及GDH活性在消除NH4+脅迫的過程中起重要作用。另外Mn、Zn單一及復(fù)合處理，水蓼葉片與根系中蛋白質(zhì)含量均與對照間無顯著性差異的結(jié)果也證明，GS活性以及GDH活性提高有力的消除了NH4+脅迫。

4 結(jié)論

Mn/Zn單一及復(fù)合處理降低了水蓼葉綠素a、葉綠素 b和葉綠素（a+b）的含量，抑制了水蓼根系的生長以及株重；水蓼根莖葉中Mn、Zn含量隨著Mn、Zn處理濃度的增加而增加，Mn、Zn含量的增加抑制了水蓼對NO3-的吸收，同時(shí)造成了葉片與根系中不同程度的NH4+脅迫，GS與GDH活性不同程度的增加有效降低了NH4+脅迫。

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Effects of Mn/Zn Single and Combined Pollution on the Nitrogen Metabolism in Polygonum Hydropiper L.

LIU Hua1, LIU Kehui2, ZHOU Zhenming1,3, SU Yinping1, CHEN Menglin1,3, CHEN Chaoshu1,3, YU Fangming1,3
1. School of Environment and Resource , Guangxi Normal University, Guilin 541004, China; 2. College of Life and Environmental Science, Guilin University of Electronic Technology, Guilin 541004, China; 3. Guangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control Theoty and Technique, Guilin 541004, China;

Hydroponic culture was conducted to study the effect of Mn and Zn combined single and pollution on the growth, heavy metals of Mn and Zn accumulation and transfer factor(TF), nitrogen metabolism in Mn-hyperaccumulator Polygonum hydropiper L.. The enzymatic activies of nitrogen metabolism including nitrate reductase (NR), glutamine synthetase (GS), glutamineate synthase (GOGAT) glutamate dehydrogenase (GDH) as well as the concentrations of chlorophyll a, b a+b, a/b, NO3-, NH4+, free proline and soluble protein in Polygonum hydropiper L. was determined. Resalts showed that Mn and Zn concentrations of roots, stems and leaves of the Polygonum hydropiper L. , with the increase Mn and Zn control concentration increased, Polygonum hydropiper L. vary 1.0 from 11.9 of Mn and vary 1.0 from 1.8 of Zn of transfer factor. It indicated that Zn had affect on transfer of Mn. Mn/Zn treatment singinficantly reduced contents of chlorophyll a, b and a+b（P<0.05）, but the chlorophyll a/b significantly increased than the control group (P<0.05). Mn/Zn treatment restrained growth of roots and biomass, when T8, root is only 64.93% and T9, biomass is only 65.45% of that in the control group. What single Zn and Mn/Zn combined pollution reduced the contents of NO3-and NR activities, when T5, NR activity in leaves and roots, respectively is 44.36% and 34.41% in the control group; but increased the contents of NH4+, T9, leaf of NH4+content is 2.35 times that of the control group and T8 root of NH4+content is 1.58 times that of the control group; GS activities significantly increased than the control group (P<0.05) of roots and leaves, GS activities are 1.32 and 1.57 times that of the control group of leaf and ront when T9; had no singinficantly efected on soluble protein of roots and leaves of Polygonum hydropiper L.. It indicated that play an important role in the process of elimination NH4+stress.

combined pollution of manganese and zinc; Polygonum hydropiper L.; nitrogen metabolism

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.03.023

X171.5

A

1674-5906（2015）03-517-05

劉華，劉可慧，周振明，蘇銀萍，陳孟林，陳朝述，于方明. Mn、Zn單一及復(fù)合污染對水蓼氮素代謝的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2015, 24(3): 517-521.

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國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41161057）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目重大專項(xiàng)計(jì)劃（桂科重 1298002-6）；廣西教育廳項(xiàng)目（2013HZ003）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014GXNSFAA118303）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目（桂科轉(zhuǎn)14122008-2）

劉華（1987年生），男，碩士，主要從事環(huán)境生態(tài)與生物修復(fù)研究。E-mail：liuh34@126.com *通信作者：于方明（1975年生），男，教授，博士，主要從事環(huán)境毒理學(xué)與土壤污染生物修復(fù)的研究。E-mail: Fmyu1215@163.com

2013-09-05