陳璐，米艷華*，萬小銘，尹本林，袁志偉，和麗忠

1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650221；2. 中國科學(xué)院地理科學(xué)研究所與資源研究所，北京 100101；3. 昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650101

外源磷素對藥用植物三七吸收砷的微區(qū)及形態(tài)分布特征影響

陳璐1，米艷華1*，萬小銘2，尹本林1，袁志偉3，和麗忠1

1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650221；2. 中國科學(xué)院地理科學(xué)研究所與資源研究所，北京 100101；3. 昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650101

三七是中國特有的珍稀藥用植物，其生長環(huán)境受地域、氣候、土壤等條件的限制，僅云南省文山州三七產(chǎn)量高、品質(zhì)好。但由于礦業(yè)開采、工業(yè)生產(chǎn)等因素使得土壤砷的背景值超標(biāo)，逐漸威脅三七的正常生長及其產(chǎn)品質(zhì)量。因此，如何降低三七砷污染是目前迫切需要解決的問題。磷與砷具有相似的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，利用磷與砷在土壤中的拮抗效應(yīng)，達(dá)到控制土壤砷危害的效果。本研究利用同步輻射X射線熒光方法（SRXRF）和高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用技術(shù)（HPLC-HG-AFS）相結(jié)合對參試三七植株進(jìn)行分析測定，從細(xì)胞微區(qū)組織層面揭示藥用植物三七在外源磷素作用下吸收As和P的相對含量分布規(guī)律和三七植株各部位的砷形態(tài)及含量特征，以及各部位的生物轉(zhuǎn)運系數(shù)及富集系數(shù)的變化。結(jié)果表明：磷和砷在三七主根部的相對含量熒光分析中保持分布規(guī)律一致的特性，說明三七根部吸收磷和砷的點位相同；添加外源磷素處理可以有效降低三七各部位三價砷和五價砷的含量，最大降幅達(dá) 50%，同時可以降低根部對砷的吸收富集系數(shù)；試驗中僅添加五價砷元素，但在三七植株各部位均檢出三價砷，說明三七體內(nèi)存在著砷還原機(jī)制；其中莖部的三價砷的含量均高于五價砷，推測莖是三七體內(nèi)砷還原反應(yīng)的主要場所。

三七；砷形態(tài)；μ-SRXRF

砷是一種有毒、致癌的類金屬元素。人類的活動使環(huán)境中的砷通過水體、土壤、植物系統(tǒng)，經(jīng)由食物鏈進(jìn)入人體，直接危及人類健康（鄧天龍等，2005）。磷是植物生長的必需元素之一，由于其與砷具有相似的生物化學(xué)性質(zhì)，因此對磷元素的關(guān)注有助于對砷的毒性研究（盧聰?shù)龋?013；Karadjova et al.，2008）。Hellweger et al.（2003）提出在磷為限制因子時，藻類對 As(V)的吸收與磷的吸收率有關(guān)，外部磷濃度的增高可減少細(xì)胞對As(V)的吸收，從而降低砷的細(xì)胞毒性（Wang et al.，2013；Pigna et al.，2010；Wang et al.，2009）。

三七[Panax Notoginseng (Burkill) F. H. Chen ex C. H. Chow]是中國名貴藥材之一，具有散瘀止血，消腫定痛等功效。其根部位是主要藥用部位，一旦藥用部分重金屬含量超標(biāo)，重金屬易在人體內(nèi)蓄積而引發(fā)毒性。已有研究表明，砷的毒性效應(yīng)與總量無顯著關(guān)系，而是與砷的形態(tài)有關(guān)（雷鳴等，2014）。通過前期大量調(diào)查分析，部分三七種植區(qū)由于產(chǎn)地土壤As含量過高（陳璐等，2014），不僅導(dǎo)致三七主要藥用部位——主根的健康風(fēng)險增加（閻秀蘭等，2011）；還會對三七的藥用質(zhì)量安全和出口貿(mào)易造成較大的影響。本研究以采自人工種植區(qū)的藥用植物三七為主要研究對象，采用同步輻射X射線熒光分析（μ-SRXRF）技術(shù)測定植物樣品中的元素含量，并進(jìn)行微區(qū)分布掃描；應(yīng)用高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用技術(shù)（HPLC-HG-AFS）測定植株樣品中As的含量及其賦存形態(tài)，分析了三七植株砷含量特征和As形態(tài)分布規(guī)律以及外源磷素的添加與三七植株吸收砷的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究三七抗砷污染方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物培養(yǎng)

選取試驗基地生長環(huán)境良好，生長一致（株高、莖粗、葉面積等基本相同）并且植株健壯的一年生三七幼苗進(jìn)行不同As質(zhì)量濃度的水培試驗，添加砷化合物為 Na2HAsO4·12H2O。水培試驗采用“完全營養(yǎng)液”配方（馮光泉等，2003），并結(jié)合三七生長特性進(jìn)行了適當(dāng)改良，配制營養(yǎng)液的試劑均為分析純。在As處理前10 d進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，期間每3天更換營養(yǎng)液1次，試驗處理3 d取樣。設(shè)置5個處理：（1）CK（不添加砷）；（2）低砷處理25 mg·L-1；（3）高砷處理50 mg·L-1；（4）低砷添加外源磷素處理（As25 mg·L-1+P100 mg·L-1）；（5）高砷添加外源磷素處理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）。各處理3次重復(fù)，置于遮陰避光、透光率在8%～12%、溫濕度適宜、通風(fēng)條件較好的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，每天向水培試驗中充氧，以保證三七正常生長所需。

1.2 X射線吸收光譜分析

由于檢測機(jī)時申請受限制，不能將全部處理樣品制片檢測，因此選取試驗設(shè)置中空白（CK）、高砷（As50 mg·L-1）和高砷添加外源磷素（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）3組試驗處理的新鮮三七幼苗的主根制片進(jìn)行檢測。選用進(jìn)口包埋劑OCT(Optimum cutting temperature compound)將幼苗的主根包埋后，在 LEICA CM1950冷凍切片機(jī)-20 ℃下切片（Ager et al.，2002），切片厚度為10 μm。將冷凍切片用邁拉膜固定在樣品框上，在-80 ℃冷凍干燥后用于 μ-SRXRF掃描。μ-SRXRF分析在北京正負(fù)電子對撞機(jī)同步輻射實驗室（BSRF）4W1B應(yīng)用微束光束線站進(jìn)行。試驗條件：儲存環(huán)電子能量為2.5 GeV，束流強(qiáng)度為150～200 mA，調(diào)節(jié)水平和垂直兩個狹縫，使入射光斑大小為20 μm×20 μm，探測器為Si（Li）固體探測器及能譜儀系列。樣品與入射光線成 45°，掃描步長為200 μm，每個掃描點的時長為60 s。同步輻射X熒光射線微束激發(fā)三七樣品的能量數(shù)據(jù)，在歸一化處理后，使用 PyMCA軟件進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)處理，OriginPro 8.0軟件繪制As元素分布圖。

1.3 植株體內(nèi)As形態(tài)測定

同時采集試驗全部處理的三七幼苗根、莖、葉樣品，清洗后將樣品凍干至恒重，在冷凍條件下研磨，保存于4 ℃下備用。植物樣品中加入7 mL浸提劑，浸提劑選用甲醇/水（1∶9）；60 ℃下，超聲2 h，5000 rmp，離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液；殘渣重復(fù)以上步驟2次，收集上清液定容至50 mL，設(shè)置3個平行樣（馬杰等，2012）。定容后的樣品用0.45 μm的醋酸纖維濾膜過濾，保存于4 ℃下待測。利用高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀（科創(chuàng)海光AFS-9800）對待測液中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和有機(jī)等其他形態(tài)As進(jìn)行檢測。檢測所得數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0進(jìn)行分析。生物轉(zhuǎn)運系數(shù)和富集系數(shù)按照如下公式計算。

生物轉(zhuǎn)運系數(shù)=地上部分的重金屬含量/地下部分的重金屬含量；

生物富集系數(shù)=植物體內(nèi)的重金屬含量/土壤中（沉積物中）的重金屬含量

2 結(jié)果分析

2.1 As在三七主根部微區(qū)分布特點

從不同處理三七主根部橫切片As元素分布圖（圖1右側(cè)）中可以看出，CK處理根部As的相對含量最低，平均在4.6左右，最高不超過5.9；圖中紅色代表檢測掃描區(qū)域As的相對含量較高（超過11.64），As50 mg·L-1處理根部As相對含量出現(xiàn)了明顯的增加，紅色高 As含量區(qū)域的數(shù)量及范圍都出現(xiàn)顯著的增加，且砷含量在7～10之間，約是CK處理的 2倍；高砷添加外源磷素處理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）根部的As含量最高檢測值為7.25，低于As50 mg·L-1處理的含量，且平均含量在5.3左右，僅比CK處理略高。說明添加外源磷素可以有效降低As在三七主根部的含量。

分析磷元素分布圖（圖1左側(cè)），CK處理根部P的平均相對含量在4～6.5，對應(yīng)砷含量較高區(qū)域的磷素含量也相對較高，在7.8～8.5之間；As50 mg·L-1處理檢測出的磷元素相對含量分布與砷元素分布呈對應(yīng)關(guān)系，且高砷含量區(qū)域大多在6.0以上；添加外源磷素處理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）根部磷元素含量基本保持在5.7～8.0之間，相比CK和As50 mg·L-1處理磷元素含量分布得更加均勻。綜合分析三七根部As和P的相對含量分布熒光圖，得出As50 mg·L-1試驗中主根部的砷含量明顯增加，添加外源磷素處理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）主根部砷相對含量降低了，說明添加外源磷素可以有效降低As在三七主根部的含量；三七主根部磷元素含量在As50 mg·L-1處理時呈大面積增加的趨勢，As50 mg·L-1+P100 mg·L-1處理中這一趨勢表現(xiàn)更加顯著，說明磷和砷元素的相對含量在三七主根部具有分布區(qū)域和規(guī)律保持一致的特點。

2.2 不同處理三七各部位間As形態(tài)分布特征

不同處理三七根、莖、葉中三價砷和五價砷的含量不同（圖2）。試驗處理培養(yǎng)液中僅添加五價砷，參試三七中均檢測出三價砷和五價砷，說明在三七體內(nèi)存在著砷的還原機(jī)制可以將五價砷還原成三價砷。CK處理各部位中三價砷和五價砷的含量近似為零；高砷處理（As50 mg·L-1）三價砷和五價砷在根、莖、葉中的含量均表現(xiàn)為最高；各部位三價砷和五價砷的含量均表現(xiàn)為根>莖>葉，同時單獨砷處理約是添加外源磷素處理的 1倍。As25 mg·L-1處理根部的砷含量明顯高于莖、葉部，與 As25mg·L-1+P100 mg·L-1相比各部位砷含量較高，但根部五價砷含量相差不大；As50 mg·L-1+P100 mg·L-1與As50 mg·L-1處理相比根、莖、葉中砷含量的降幅較大，根部五價砷的降幅最大約300 mg·kg-1；除CK外的所有處理莖部均呈現(xiàn)三價砷含量高于五價砷的情況，這可能是由于莖承擔(dān)著運輸養(yǎng)分及能量轉(zhuǎn)移的功能，使根部的砷隨著養(yǎng)分向上遷移，而葉片的砷隨著能量向下運輸，在此聚集所致；同時莖部可能也存在大量的砷還原基質(zhì)?？傮w來看，無論三價砷還是五價砷根部的含量都是最高的，這與前期研究保持一致（陳璐等，2014）。在試驗處理中僅添加五價砷元素，但在根、莖、葉中均有三價的砷檢出，說明三七體內(nèi)存在著大量的砷還原機(jī)制，危害植物生長；其中莖的表現(xiàn)尤為明顯，所有試驗處理的三價砷的含量均高于五價砷，莖可能是三七體內(nèi)砷還原機(jī)制的主要場所，但這還需要進(jìn)一步的試驗來證實。

圖1 不同處理三七主根部橫切片中As元素分布圖Fig. 1 The Arsenic distribution in P. Notoginseng root cross sections of different processing

對不同處理三七莖、葉的生物轉(zhuǎn)運系數(shù)和根部的富集系數(shù)分析。按照三七植株由上至下順序分析，見表 1，葉片中三價砷的生物轉(zhuǎn)運系數(shù) As50 mg·L-1處理表現(xiàn)最高為0.212，As25 mg·L-1和As25 mg·L-1+P100 mg·L-1處理之間沒有顯著差異；五價砷則表現(xiàn)為單獨砷處理（As25 mg·L-1和As50 mg·L-1）的生物轉(zhuǎn)運系數(shù)低于添加外源磷素處理（As25 mg·L-1+P100 mg·L-1和As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）；不同試驗處理莖部三價砷的生物轉(zhuǎn)運系數(shù)無顯著差異，五價砷的生物轉(zhuǎn)運系數(shù)除As25 mg·L-1+P100 mg·L-1最低為0.093外其余處理均無差異；根部三價砷和五價砷的生物富集系數(shù)物均是 As50 mg·L-1+P100 mg·L-1處理顯著低于其他處理。因此添加外源磷素可以有效降低三七根部對砷的吸收富集，但對砷在三七植株體內(nèi)的轉(zhuǎn)運影響不明顯。

圖2 不同處理三七各部位的As形態(tài)含量Fig. 2 Different concentrations of each part of the deal with P. Notoginseng arsenic content in form

3 討論

早期的研究表明，在高磷濃度下，植物中PO43-與AsO43-競爭膜轉(zhuǎn)運蛋白，兩者之間表現(xiàn)為拮抗作用（Sharples et al.，1999）。水稻（Meharg et al.，1990）、大麥（Asher et al.，1979）、苜蓿（Khattak et al.，1991）等普通植物以及砷耐性植物絨毛草（Meharg et al.，1994；Meharg et al.，1992；Meharg et al.，1994），增加磷素添加量可降低其根系、莖葉和籽粒中的砷濃度。超富集植物蜈蚣草在高磷處理時磷與砷表現(xiàn)為協(xié)同（促進(jìn)）作用，施磷有助于植物對砷的吸收和累積（陳同斌等，2002）。本研究通過對相同處理三七根部砷和磷的相對含量分布圖的比較，發(fā)現(xiàn)同一組試驗中砷含量較高區(qū)域?qū)?yīng)的磷元素的含量也相對較高，這一趨勢在高砷（As50 mg·L-1）處理中的表現(xiàn)尤為明顯。這可能是磷與砷具有相同的競爭吸附位點（雷梅等，2003；Wang et al.，2009），植物在吸收磷素養(yǎng)分的同時也吸收了砷，導(dǎo)致砷和磷元素在三七根部的相對含量分布情況保持一致。添加外源磷素處理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1），三七根部的砷含量明顯降低，相應(yīng)的磷元素沒有呈明顯的增加，但相比CK和As50 mg·L-1處理根部的磷元素含量分布更為均勻，這可能是外源磷素的存在抑制了三七根系對砷的吸收，增強(qiáng)了對As(V)的還原、降低硫醇/疏基形成作用，從而起到解毒作用（Tu et al.，2004）。

表1 不同處理三七各部位的生物轉(zhuǎn)運系數(shù)及富集系數(shù)表Table 1 The transfer coefficient and bioconcentration factors of various P. Notoginseng parts in different concentrations of arsenic

高砷處理（As50 mg·L-1）的三價砷和五價砷在根、莖、葉中的含量表現(xiàn)為最高；在高砷處理中添加外源磷素（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1）根、莖、葉中的三價和五價砷出現(xiàn)了明顯下降；低砷處理中也有相似的表現(xiàn)?？傮w來看，無論三價砷還是五價砷根部的含量都是最高的，這與前期研究保持一致（陳璐等，2014）。許多研究表明，As(Ⅲ)對植物的生長抑制效果明顯大于 As(V)（Carbonell-Barraehina et al.，1998；Sachs et al.，1971；Marin et al.，1992），而植物體內(nèi)的砷以 As(Ⅲ)形態(tài)存在可以避免 As(V)對氧化磷酸化過程的破壞，一些學(xué)者認(rèn)為，植物體內(nèi)As(V)向As(Ⅲ)的轉(zhuǎn)化可能與植物體內(nèi)谷胱甘肽類的還原性硫醇類物質(zhì)有關(guān)，這些物質(zhì)可以通過脫硫反應(yīng)將 As(V)轉(zhuǎn)化為 As(Ⅲ)（Pickering et al.，2000；Delnomdedieu et al.，1993）。在藥用植物三七主根部砷的主要檢出形態(tài)是三價砷和五價砷，說明三七體內(nèi)可能存在著具有還原性的酶或是硫醇類物質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究利用μ-SRXRF技術(shù)分析三七根部As和P的相對含量分布熒光發(fā)現(xiàn)，As50 mg·L-1試驗中主根部的砷的相對含量明顯高于添加外源磷素處理（As50 mg·L-1+P100 mg·L-1），說明添加外源磷素可以有效降低 As在三七主根部的含量；且 As50 mg·L-1處理主根部磷元素的相對含量出現(xiàn)大面積的增加，這一趨勢在As50 mg·L-1+P100 mg·L-1處理中表現(xiàn)得更加顯著，結(jié)合對生物轉(zhuǎn)運系數(shù)和富集系數(shù)的分析得出，磷元素和砷元素根部具有相同的吸附位置，且三七生長環(huán)境中磷元素大量存在會抑制根部對砷的吸收，也就是說添加外源磷素可以有效降低三七根部對砷的吸收富集。

本試驗處理中僅添加五價砷元素，但在根、莖、葉中均有三價的砷檢出，說明三七體內(nèi)存在著大量的砷還原機(jī)制；其中所有試驗處理莖部的三價砷的含量均高于五價砷，莖可能是三七體內(nèi)砷還原機(jī)制的主要場所，但這還需要進(jìn)一步的試驗來證實。

致謝：

本文部分試驗內(nèi)容得到北京正負(fù)電子對撞機(jī)國家實驗室BSRF的4W1B應(yīng)用微束光束線站的支持；μ-SRXRF數(shù)據(jù)處理得到中國科學(xué)院高能物理研究所多為老師指導(dǎo)和幫助，在此一并致謝。

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Effect of Micro and Morphology Distribution of Panax Notoginseng Uptake of Arsenic with Exogenous Phosphorus

CHEN Lu1, MI Yanhua1*, WAN Xiaoming2, YIN Benlin1, YUAN Zhiwei3, HE Lizhong1
1. Agri-Food Quality Standard and Testing Technology Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650221, China; 2. Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research, CAS, Beijing 100101, China; 3. The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650101, China

Panax Notoginseng is China’s unique rare medicinal plants, its growth environment by region, climate, soil and other conditions, but its only in Wenshan of Yunnan Province have high yield and good quality. However, due to mining, industrial production and other factors, the background value of soil arsenic exceeded, and gradually threatened the normal growth and product quality of P. Notoginseng. Therefore how to reduce arsenic accumulation in P. Notoginseng is urgent. Structurally similar phosphorus and arsenic have similar physical and chemical properties, the use of antagonistic effect of phosphorus and arsenic in the soil, to control soil arsenic hazard effect. This study by synchrotron radiation X-ray fluorescence (μ-SRXRF) method and high performance liquid chromatography-combination of atomic fluorescence spectrometry (HPLC-HG-AFS), from the micro cell tissue area level reveal P. Notoginseng medicinal plants under the effect of exogenous p adsorption of arsenic distribution rule and P. Notoginseng characteristics of arsenic form and content in different parts of the plant, and the change of the biological transport coefficient and the enrichment coefficient of the various parts. The results showed that distribution characteristics of phosphorus and arsenic in the main root of P. Notoginseng fluorescence analysis was the same and description of P. Notoginseng root uptake of phosphorus and arsenic level the same. Addition of exogenous phosphorus treatment can effectively reduce the content of P. Notoginseng parts of the trivalent and pentavalent arsenic, the largest decline of 50%, also can reduce root absorption of arsenic enrichment coefficient. Test adding only pentavalent arsenic, but in all parts of the plant P. Notoginseng trivalent arsenic were detected, indicating that there are a lot of P. Notoginseng body arsenic reduction mechanism. The content of trivalent arsenic stems were higher than pentavalent arsenic, stems are the main places in P. Notoginseng of arsenic reduction mechanism.

Panax Notoginseng; Arsenic speciation; synchrotron radiation X-ray fluorescence (μ-SRXRF)

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.09.023

X592

A

1674-5906（2015）09-1576-06

陳璐，米艷華，萬小銘，尹本林，袁志偉，和麗忠. 外源磷素對藥用植物三七吸收砷的微區(qū)及形態(tài)分布特征影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2015, 24(9): 1576-1581.

CHEN Lu, MI Yanhua, WAN Xiaoming, YIN Benlin, YUAN Zhiwei, HE Lizhong. Effect of Micro and Morphology Distribution of Panax Notoginseng Uptake of Arsenic with Exogenous Phosphorus [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(9): 1576-1581.

國家自然科學(xué)基金項目（21267024）；云南省科技計劃青年項目（2014FD063）；云南省創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目（2014HB059）

陳璐（1984年生），女，研究實習(xí)員，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail: clcc_006@163.com *通信作者。

2015-04-28