GKNs 在胃癌中的研究進(jìn)展

劉 姣 凌 暉

目前發(fā)現(xiàn)胃動(dòng)蛋白家族包括3 個(gè)成員，即胃動(dòng)蛋白-1(GKN1，AMP-18，gastrokine-1)，胃動(dòng)蛋白-2(GKN2，GDDR，gastrokine-2)，胃動(dòng)蛋白-3(GKN3，gastrokine-3)。30 年前，在胃激素促胃液素的克隆過(guò)程中，一種未知cDNA 被分離出來(lái)。這種cDNA 后來(lái)被人發(fā)現(xiàn)它編碼一種18kDa 的蛋白，AMP -18，在人、鼠和豬當(dāng)中都有很高的序列同源性，說(shuō)明其在進(jìn)化上具有高度的保守性，AMP -18 在胃竇中高表達(dá)，但在其他組織中表達(dá)減少或無(wú)表達(dá)。之后，在所觀察到的這種生長(zhǎng)因子或“細(xì)胞因子樣”活性物質(zhì)傾向于胃上皮細(xì)胞的前提下，經(jīng)HUGO 基因命名委員會(huì)(HGNC)批準(zhǔn)，人們將這種以前被稱為AMP18、CA11、BRICD1 和 TFIZ2 的 蛋 白，正 式 命 名 為GKN1［1］。后來(lái)杜建軍博士克隆到胃癌下調(diào)或缺失的一種新基因，命名為GDDR［2］。GDDR 編碼的蛋白與GKN1 結(jié)構(gòu)相似，并為同源蛋白，所以GDDR 又稱為GKN2。這是GKN 家族的第2 個(gè)成員，此外，GDDR的基因產(chǎn)物可經(jīng)二硫鍵與三葉草蛋白家族成員TFF1結(jié)合形成異源二聚體，因此GDDR 又名為TFIZ1［trefoil factor interaction(z)1］［3］。此外，這個(gè)家族的第3 個(gè)成員GKN3，不像GKN1 和GKN2 是有功能的，GKN3 在人體內(nèi)是作為無(wú)效的假基因存在的。然而，GKN3 在大量其他的哺乳動(dòng)物，包括小鼠中都發(fā)揮出功能。已知的證據(jù)顯示，GKNs 在調(diào)節(jié)胃上皮動(dòng)態(tài)平衡及在幽門螺旋桿菌對(duì)宿主的免疫反應(yīng)中都具有重要的作用，而且，由于其表現(xiàn)出抗增殖作用，被認(rèn)為可以抑制腫瘤發(fā)展。尤其是GKN2 和胃特異性腫瘤抑制蛋白三葉因子(TFF1)之間已知的相互作用很關(guān)鍵。

一、基因結(jié)構(gòu)

在哺乳動(dòng)物中GKN 是高度保守的直系同源物，但在魚類或昆蟲中一直沒(méi)有描述，因此，推測(cè)GKNs是高級(jí)脊椎動(dòng)物的進(jìn)化創(chuàng)新。迄今為止，在所有的哺乳動(dòng)物研究中，基因組水平的3 個(gè)GKN 基因旁系同源物顯示他們嚴(yán)格保守，它們被緊緊地聚集在一起［4］。人類GKN 基因位于染色體2p13.3。GKN3 基因在鼠科動(dòng)物中定位于染色體6qD1。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與BRICHOS 域

GKN 基因編碼小(181 ～184 個(gè)氨基酸)的蛋白質(zhì)。除了具有類似的相對(duì)分子質(zhì)量，GKN 蛋白也有統(tǒng)一的結(jié)構(gòu)特征，最顯眼的是神秘的BRICHOS 域和一個(gè)羧基末端片段，這顯示了GKN 有高度保守的氨基酸序列。GKN 蛋白質(zhì)的最鮮明的結(jié)構(gòu)特征是該BRICHOS 域，它是1 個(gè)100 個(gè)氨基酸的序列，它被一小部分的無(wú)相關(guān)性的蛋白質(zhì)所共享。雖然數(shù)量不多，但BRICHOS 蛋白質(zhì)具有重要的臨床意義，它與人類疾病如癡呆、呼吸系統(tǒng)疾病、癌癥有聯(lián)系［5］。關(guān)于BRICHOS 域蛋白與人類疾病相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)越來(lái)越多，這對(duì)GKN 的了解起了關(guān)鍵性作用。分子研究進(jìn)一步闡明了BRICHOS 域的功能，它參與細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、加工肽、分子伴侶功能/蛋白質(zhì)折疊、分泌等。BRICHOS 域的3 級(jí)結(jié)構(gòu)是高度保守的，并且有相似的重要功能。盡管整體上共享重要的同源性結(jié)構(gòu)，個(gè)別GKN 旁系卻有少量的結(jié)構(gòu)進(jìn)化。雖然沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)證明，這些結(jié)構(gòu)變化一定會(huì)影響GKN 功能。這方面最顯著的證據(jù)是半胱氨酸38 在所有哺乳動(dòng)物GKN2 直系同源基因中存在，但在GKN1 或GKN3 中卻沒(méi)有?？傊?，GKNs 享有強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)同源性意味著它們?cè)隗w內(nèi)密切相關(guān)，然而，其中個(gè)別成員有獨(dú)特的功能也正是進(jìn)化所產(chǎn)生的結(jié)果。

三、GKNs 在正常組織中表達(dá)

GKNs 表達(dá)的主要部位是胃，除少量在子宮、胎盤和十二指腸散在表達(dá)［6，7］。同樣的，GDDR 在胃腸道高度表達(dá)，包括小腸、胃、胰腺、直腸和結(jié)腸，而它不存在于心臟、骨骼肌、肝、脾和腦中，證明它在正常胃腸道黏膜特異性表達(dá)。因?yàn)镚KN3 在人類中是缺失的，所以常在小鼠中進(jìn)行GKN3 的研究，研究顯示GKN3 蛋白和mRNA 在胃竇腺細(xì)胞、胃底黏膜頸部亞群細(xì)胞(MNCs)和十二指腸布倫納腺中表達(dá)。

四、在胃腫瘤中的表達(dá)以及其對(duì)胃腫瘤的影響

GKN1 和GKN2 在胃癌中明顯下調(diào)［8，9］。已知的研究提示GKNs 可能作為胃特異性的腫瘤抑制基因，意味著其在臨床預(yù)測(cè)和診斷中有潛在效用［10］。GKN1 在胃腫瘤中表達(dá)減少是在做正常胃組織黏膜和胃腫瘤的差異篩選分析法中被首次發(fā)現(xiàn)。有研究表明，GKN1 在彌漫型胃癌中缺失，腸型胃癌中缺失，而GKN2 類似GKN1，其缺失的頻率在彌漫型胃癌和腸型胃癌中分別為85%和54%，總體而言，GKN1 的表達(dá)缺失與GKN2 呈正相關(guān)［10］。除了胃腫瘤組織，GKN1 在胃癌細(xì)胞系中也普遍缺失，在7 個(gè)胃癌細(xì)胞系(MKN28、MKN45、AGS、N87、SNU 1、SNU 16 和KATO)中GKN1 表達(dá)均顯著下調(diào)或缺失，GKN2 被證實(shí)在AGS、KATO Ⅲ和HCT-1 胃癌細(xì)胞系中表達(dá)完全缺失，而在SGC - 7901、N87、MKN45、MGC803 和BGC823 細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)或缺失［11］。

GKN1 可能在胃癌的形成和發(fā)展中作為一種抑癌基因發(fā)揮顯著的作用［6］。GKN1 在胃黏膜的防御機(jī)制中起著重要的作用，它是胃黏液層的組成成分之一。GKN1 基因可能通過(guò)抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial - mesenchymal transition，EMT)和腫瘤細(xì)胞的遷移發(fā)揮重要作用［12］。GKN1 還可以通過(guò)激活p16/Rb 通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生衰老［13］。因此，GKN1 基因失活可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增生，且在胃癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮啟動(dòng)作用［12］。GKN1 蛋白可以抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［6］。關(guān)于GKN2 的研究顯示，GKN2 基因的瞬時(shí)表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的增生。GKN2 蛋白在胃表面黏膜上皮的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，具有維持胃黏膜完整和促進(jìn)受損黏膜的修復(fù)以及調(diào)節(jié)胃黏膜上皮細(xì)胞增生和凋亡的作用［1］。人正常胃黏膜上皮中可分離出一種相對(duì)分子質(zhì)量約25kDa 的復(fù)合物，具有保護(hù)和修復(fù)胃黏膜的作用，這種復(fù)合物是由GKN2 及TFF1之間通過(guò)二硫鍵結(jié)合而生成的一個(gè)異源二聚體復(fù)合物［3］。但在胃癌細(xì)胞中GKN2 的表達(dá)或缺失，導(dǎo)致TFF1 -GKN2 異二聚體形成減少，使TFF1 失去正常的功能從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［14］。因此，GKN2可作為監(jiān)控胃癌患者疾病進(jìn)展和預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)。GKN2 的過(guò)表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞增生、遷移和侵襲，并使細(xì)胞周期阻滯在G1～S 期。另外一種胃動(dòng)蛋白GKN3，在人類基因中也存在表達(dá)缺失。在遠(yuǎn)端胃GKN3 編碼的是與TFF-2(三葉因子2)共表達(dá)的分泌蛋白，并且能夠識(shí)別一種在近端胃的Griffinia simplicifolialectin(GS)-Ⅱ-陽(yáng)性頸黏液細(xì)胞(MNC)亞群。GKN3 編碼一種與GKN1 和GKN2 功能不同的GKN，并且其過(guò)度表達(dá)可能抑制胃黏膜萎縮中的上皮細(xì)胞增生。

五、GKNs 在胃炎和癌前疾病中表達(dá)

胃炎至胃癌的組織病理學(xué)進(jìn)程是慢性胃炎，胃黏膜萎縮，腸上皮化生，不典型增生和最終的胃癌。幾個(gè)研究小組已經(jīng)表明，幽門螺桿菌感染的胃黏膜組織中GKN1 和GKN2 表達(dá)下調(diào)。GKN1 表達(dá)在正常黏膜、炎癥、癌前組織、癌組織中逐步減少。胃黏膜損傷后，在GKN1 的存在下胃黏膜很快恢復(fù)。相反，如果該蛋白下調(diào)，修復(fù)過(guò)程受影響。這些研究結(jié)果表明，Hp 慢性持續(xù)性感染導(dǎo)致GKN1 的表達(dá)減少，它的表達(dá)在幽門螺桿菌根除后上調(diào)［15］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥可通過(guò)減少GKN1 的表達(dá)從而誘導(dǎo)胃損傷?？傊?，已有的數(shù)據(jù)表明，GKN1 表達(dá)可能與胃黏膜的炎癥損傷有關(guān)。

GKN2 被確定為一個(gè)胃黏膜TFF2 的結(jié)合配偶體。據(jù)報(bào)道該GKN2 的表達(dá)在幽門螺桿菌感染性胃炎和胃癌中降低。正常人胃部GKN2 呈內(nèi)源性高表達(dá)，但在幽門螺桿菌(helicobacter pylori，Hp)感染胃部直至形成胃癌的期間GKN2 顯示出漸進(jìn)性的表達(dá)缺失，研究顯示，在胃炎基礎(chǔ)上發(fā)生胃癌的鼠模型中GKN2 基因表達(dá)被顯著抑制，該腫瘤增生與促炎性因子的驅(qū)動(dòng)及致癌的轉(zhuǎn)錄因子STAT3 的活化相關(guān)。相反，人類胃組織芯片研究顯示，根除慢性Hp 感染后GKN2 在所有上調(diào)轉(zhuǎn)錄組基因中表達(dá)上調(diào)最為明顯。IL-1β、TNF-α、IFN -γ 及IL -6 這些促炎性因子在胃癌細(xì)胞系中可以下調(diào)GKN2 基因的表達(dá)［2］。

幽門螺旋桿菌定殖胃上皮誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)使活性氧的生成和一氧化氮水平增加，可能影響DNA 和突變最終導(dǎo)致胃癌。有報(bào)道GKN1 表達(dá)抑制NF-κB的活化和核轉(zhuǎn)位，而NF-κB 是連接胃炎和胃癌的關(guān)鍵機(jī)制［16］。胃黏膜受損是由于攻擊因子壓倒黏膜防御的結(jié)果，一旦攻擊因子壓倒黏膜防御，胃黏膜的完整性可能會(huì)遭到破壞。幽門螺桿菌(Hp)感染被證實(shí)會(huì)損傷胃黏膜，是慢性胃炎和消化性潰瘍最常見(jiàn)的病因。有研究表明，GKN1、GKN2 在表面胃上皮細(xì)胞和腺的上半部分大量表達(dá)，但不存在于較深胃腺，這表明GKN1 可能發(fā)揮胃黏膜的防御屏障的作用。

六、GKNs 與TFF 的關(guān)系

GKN 和三葉因子家族是在正常胃黏膜上皮細(xì)胞中大量特異性表達(dá)且結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的兩個(gè)蛋白家族。三葉因子家族(TFF)肽是胃黏膜上皮細(xì)胞主要分泌產(chǎn)物，它在細(xì)胞保護(hù)、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答中發(fā)揮多種作用，且它在胃中調(diào)節(jié)黏膜修復(fù)和抑制腫瘤的形成。TFF1 缺乏可促使胃癌發(fā)生，而TFF2 缺乏增加胃竇炎，TFF2 也在一些人體胃腺癌病例中下調(diào)。在人類組織樣品，TFF2 啟動(dòng)子DNA 的甲基化在幽門螺旋桿菌感染的時(shí)間開始和在整個(gè)胃腫瘤進(jìn)展的過(guò)程中增加。TFF3 在非腫瘤胃黏膜中的表達(dá)是罕見(jiàn)的，但在大約50%的胃癌中發(fā)生。

研究首先發(fā)現(xiàn)GKN2 和TFF1 的聯(lián)系，不同于其他家族成員，GKN2 含有一個(gè)38 位的半胱氨酸殘基，其間的二硫鍵就是由位于TFF1 58 位的半胱氨酸殘基和它的這個(gè)半胱氨酸殘基構(gòu)成，連接形成的二聚體復(fù)合物［17］。一些報(bào)告表明，在實(shí)驗(yàn)鼠中GKN2 和TFF2 也以非共價(jià)鍵結(jié)合。該GKN2 的表達(dá)，平行于該TFF 基因，表明它們可以一起在維持胃腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。胃癌中GKN2 與TFF1 蛋白的共表達(dá)遭到破壞時(shí)，GKN2 表達(dá)缺失時(shí)誘導(dǎo)TFF1 表達(dá)恢復(fù)能促進(jìn)胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，GKN2 可以通過(guò)抑制GKN1 來(lái)調(diào)節(jié)胃黏膜的動(dòng)態(tài)平衡［18］。GKN3 過(guò)表達(dá)可以抑制細(xì)胞增生。GKN3 編碼的蛋白質(zhì)和三葉因子(TFF)2 在正常胃黏膜上皮中共表達(dá)，在胃萎縮中高表達(dá)，但二者沒(méi)有通過(guò)二硫鍵形成異二聚體，免疫共沉淀反應(yīng)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)［4］。

七、展 望

當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)資料表明胃動(dòng)蛋白與多種疾病發(fā)生相關(guān)，且是胃組織特異性的抑癌基因，它在正常胃組織中表達(dá)，而在大多數(shù)胃癌及癌前病變中表達(dá)下調(diào)或缺失，并且和幽門螺桿菌感染，三葉草因子家族等存在著復(fù)雜聯(lián)系，在胃癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。國(guó)內(nèi)外研究者進(jìn)行了大量研究，尤其是對(duì)GKN1 和胃癌關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，但關(guān)于胃動(dòng)蛋白家族的其他成員及胃動(dòng)蛋白表達(dá)的作用機(jī)制卻不完全清楚，相信對(duì)以上問(wèn)題進(jìn)行深入研究將為胃癌的治療提供新的方向。

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