李梅青，張 瑜，代蕾莉，孔祥淋，杜曉妹

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，安徽 合肥 23 0036）

Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取明綠豆SOD工藝

李梅青1,2，張 瑜1，代蕾莉1，孔祥淋1，杜曉妹1

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，安徽 合肥 23 0036）

為了充分提取明綠豆中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），選用Plackett-Burman試驗設(shè)計對影響磷酸鹽緩沖液提取明綠豆SOD比活力的7 個因素進(jìn)行評價，篩選出具有顯著效應(yīng)的3 個因素液固比、磷酸鹽緩沖液pH值和超聲水浴溫度。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化出主要影響因素的最佳參數(shù)水平。結(jié)果表明：采用液固比22∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH 7、超聲功率140 W、超聲時間 20 min、超聲水浴溫度44 ℃、水浴浸提時間1.5 h、水浴浸提溫度60 ℃的組合，明綠豆SOD的實際比活力為856.95 U/mg。與傳統(tǒng)SOD源相比，明綠豆SOD含量處于較高水平，可成為一種新的植物SOD源。

明綠豆；超氧化物歧化酶；超聲輔助提?。籔lackett-Burman試驗設(shè)計；響應(yīng)面設(shè)計

綠豆，為豆科草本植物綠豆（Phaseolus radiatus）的成熟種子?！侗静菥V目》云：“綠豆，消腫治痘之功雖同于赤豆，而壓熱解毒之力過之”；并可“解金石、砒霜、草木一切諸毒”。《本草求真》曰：“綠豆味甘性寒，能厚腸胃、潤皮膚、和五臟及資脾胃”?，F(xiàn)代藥理研究表明綠豆具有抗菌抑菌[1]、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、提高免疫力[4]、降血脂[5]、解毒[6]等作用。

SOD能快速有效地清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基，在防止生物體免受超氧陰離子自由基損傷[7]、抗輻射、抗腫瘤、提高人體免疫力、抗壓力和疲勞[8-9]、預(yù)防局部缺血再灌注損傷[10]、治療動脈血管粥樣硬化[11]、治療脂溢性皮膚炎癥[12]及延緩機體衰老等方面起到重要作用[13]，在食品、農(nóng)業(yè)及化妝品行業(yè)的應(yīng)用也越來越廣泛[14]。但是過去大多從血液中提取，不僅工藝復(fù)雜、制備成本高、不易常溫保存，且存在艾滋病等血液病毒交叉感染的潛在危險。植物SOD則有較高的使用安全性，國際衛(wèi)生組織已停止動物性SOD的使用[15]。所以，從植物源中獲取SOD正成為熱點。

明光綠豆以其色澤晶瑩碧綠、粒大皮薄、湯清易爛、清香可口等特點，質(zhì)量為全國之冠，被稱為“明綠”，曾經(jīng)被作為貢品。2008年，“明光綠豆”獲得國家原產(chǎn)地保護(hù)標(biāo)志，以下簡稱“明綠豆”。國內(nèi)尚無從明綠豆中提取SOD的相關(guān)研究報道。本實驗以明綠豆為材料，以磷酸鹽緩沖液代替有機溶劑，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman試驗設(shè)計[16]和響應(yīng)面試驗設(shè)計[17-18]對其SOD的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為開發(fā)利用明綠豆SOD酶源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明綠豆由安徽燕之坊食品有限公司提供。

鄰苯三酚 上海生化試劑所；考馬斯亮藍(lán)G-250上海綠鳥科技發(fā)展有限公司；牛血清蛋白 美國Simga公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LR16-A高速冷凍離心機 北京雷勃爾離心機有限公司；UV-5800PC掃描型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；KQ5200DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活性及蛋白質(zhì)的測定

SOD酶活力的測定采用修正的鄰苯三酚自氧化法[19]：一定條件下，在1 mL反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時的酶量為1 個酶活力單位（1U）。

蛋白質(zhì)的測定：參照考馬斯亮藍(lán)G-250法[20]，以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

SOD比活力按下面公式計算：

1.3.2 明綠豆SOD提取工藝流程

明綠豆→低溫粉碎并過40 目篩→超聲輔助磷酸鹽緩沖液（內(nèi)含1 mmol/L的EDTA）提取→熱水浴處理→離心（4 ℃、10 000 r/min、20 min）→SOD粗提取液（上清液）

1.3.3 單因素試驗

以明綠豆SOD比活力為指標(biāo)，考察7個影響明綠豆SOD比活力的因素，得出單因素對SOD比活力的變化規(guī)律，并確定7 個單因素的最佳值。單因素試驗采用的固定參數(shù)分別為：液固比20∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH 7.6、超聲功率100 W、超聲水浴溫度40 ℃、超聲時間20 min、水浴浸提溫度50 ℃、水浴浸提時間2 h。分別固定其中的6個因素，變化另1個因素進(jìn)行優(yōu)化，因素變化范圍分別為：液固比5∶1～30∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH 6.4～8.0、超聲功率80～200 W、超聲水浴溫度25～45 ℃、超聲時間5～25 min、水浴浸提溫度30～70 ℃、水浴浸提時間1～3 h。

1.3.4 Plackett-Burman試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗設(shè)計法，對上述影響因素進(jìn)行篩選。每個因素分別取低（—1）和高（+1）兩個水平，共12 個試驗組合。每個處理重復(fù)3 次，取平均值為試驗結(jié)果。

1.3.5 Box-Behnken試驗設(shè)計方案

在Plackett-Burman試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對明綠豆SOD提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。利用Design-Expert 8.0.5b軟件，采用Box-Behnken建立三因素三水平數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液固比對SOD比活力的影響

圖 1 液固比對SOD比活力的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction rate of SOD

由圖1可知，在液固比5∶1～20∶1（mL/g）范圍內(nèi)，明綠豆SOD比活力隨著溶劑體積的增大而增大，這主要是由于溶劑中溶質(zhì)的濃度差和溶劑能夠溶解的物質(zhì)的量在不斷增大導(dǎo)致的。在液固比達(dá)到20∶1（mL/g）后，SOD比活力逐漸的下降。不同液固比條件下，所得SOD比活力有顯著性差異（P＜0.05）?？紤]到SOD的提取率及提取難度問題，確定明綠豆SOD提取的液固比為20∶1（mL/g）。

2.1.2 磷酸鹽緩沖液pH值對SOD比活力的影響

圖 2 磷酸鹽緩沖液pH值對SOD比活力的影響Fig.2 Effect of phosphate buffer pH on the extraction rate of SOD

由圖2可以看出，磷酸鹽緩沖液pH 6.8時SOD的比活力最高，隨后磷酸鹽緩沖液pH值繼續(xù)增加則導(dǎo)致SOD比活力逐漸降低，pH值越偏離6.8，SOD比活力差異越顯著（P＜0.05）。因為SOD有一定的酸堿耐受性，pH值過低或過高都會影響酶活，所以pH 6.8磷酸鹽緩沖液較適宜提取SOD。

2.1.3 超聲功率對SOD比活力的影響

圖 3 超聲功率對SOD比活力的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of SOD

由圖3可知，明綠豆SOD比活力在80～140 W范圍內(nèi)隨著超聲功率的增大而增大，當(dāng)超聲功率達(dá)到140 W時，酶比活力最大。80～140 W范圍內(nèi)時SOD比活力之間的差異極顯著，之后差異顯著。這主要是因為隨著功率的增加，溶質(zhì)的擴散速度也增大，當(dāng)功率達(dá)到一定程度后，溶質(zhì)擴散速率的增加對酶的提取影響減小?？紤]到能量的消耗和成本問題，選擇超聲功率為140 W較適宜。

2.1.4 超聲時間對SOD比活力的影響

圖 4 超聲時間對SOD比活力的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction rate of SOD

由圖4可知，5～20min范圍內(nèi)，SOD比活力隨超聲時間的延長呈上升趨勢且差異顯著（P＜0.05），當(dāng)超聲20 min時，SOD比活力達(dá)到最大值。20 min后，隨著時間的延長，SOD比活力略有下降。由Fick擴散定律可知得率與提取時間呈正比，在一定條件下，超聲時間越長得率越高[16]；但是時間太長會使擴散次數(shù)降低，反而影響SOD的得率。所以，本試驗選擇超聲時間為20 min。

2.1.5 超聲水浴溫度對SOD比活力的影響

圖 5 超聲水浴溫度對SOD比活力的影響Fig.5 Effect of ultrasonic-waterbath temperature on the extraction rate of SOD

由圖5可知，超聲水浴溫度對SOD比活力影響差異顯著，在25～40 ℃范圍內(nèi)，溫度升高能提高明綠豆SOD的得率。當(dāng)溫度超過40 ℃時，SOD比活力逐漸降低。這可能是因為高溫引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化[21]，從而使SOD容易轉(zhuǎn)移到溶液中。但是，過高的溫度又會引起SOD結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞SOD的活性。所以，選取40 ℃作為提取超聲水浴溫度。

2.1.6 水浴浸提時間對SOD比活力的影響

圖 6 水浴浸提時間對SOD比活力的影響Fig.6 Effect of subsequent waterbath extraction duration on the extraction rate of SOD

由圖6可知，水浴浸提時間過短，達(dá)不到分離提取效果，影響提取SOD的純度，提取時間過長又使SOD比活力損失明顯，試驗表明浸提時間為1.5 h較適宜。

2.1.7 水浴浸提溫度對SOD比活力的影響

圖 7 水浴浸提溫度對SOD比活力的影響Fig.7 Effect of subsequent waterbath temperature on the extraction rate of SOD

圖7表明，在30～60 ℃水浴中進(jìn)行熱處理時，SOD比活力先隨著水浴溫度的升高而升高且差異顯著，然后逐漸降低。水浴浸提溫度不僅由蛋白質(zhì)溶解度特性決定，還與酶的最適溫度有關(guān)。故本試驗最合適水浴浸提溫度選60 ℃。

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計對關(guān)鍵影響因素的確定

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值見表1。利用Mintab1 5.0對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表 1 Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 1 Plackett-Burman design and results

表 2 試驗設(shè)計方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA of Plackett-Burman design experiments

由表2可知，主效應(yīng)P值為0.045，表明Plackett-Burman試驗設(shè)計因素在所選取的水平范圍內(nèi)對明綠豆SOD比活力的影響顯著，同時決定系數(shù)R2為0.900 8，說明回歸有效，試驗設(shè)計可靠。

由表2還可以看出，液固比、磷酸鹽緩沖液pH值、超聲水浴溫度是影響明綠豆SOD比活力的主要因素，所以在下一步的響應(yīng)面分析中，重點考察這3 個因素的最優(yōu)水平范圍。其他條件采用單因素試驗的最佳條件：超聲功率140 W、超聲時間20 min、水浴浸提時間1.5 h、水浴浸提溫度60 ℃。

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗設(shè)計

表 3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and results

表 4 明綠豆SOD提取參數(shù)回歸方差分析Table 4 ANOVA of quadratic polynomial model

經(jīng)回歸擬合后，得到以明綠豆SOD比活力（Y）為響應(yīng)值的回歸方程為：

Y=853.10+121.10A—5.81B—13.48C—53.95AB+ 41.14AC+96.04BC—223.06A2—208.25B2—74.93C2

由表4可知，模型的P值小于0.001，表明該模型二次方程極顯著，失擬項不顯著（P=0.468 7）。各因素對明綠豆SOD比活力影響大小順序：液固比＞超聲水浴溫度＞磷酸鹽緩沖液pH值。一次項A極顯著，二次項A2、BC、B2、C2極顯著，交互項AB顯著?；貧w方程決定系數(shù)R2為0.980 7，說明該回歸方程能很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以用其確定最佳提取工藝條件。

圖 8 液固比、磷酸鹽緩沖液pH值和超聲水浴溫度交互影響明綠豆SOD比活力的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plots for the interactive effects of solid-to-liquid ratio, ultrasonic-waterbath temperature and phosphate buffer pH on the specifi c activity of SOD

比較圖8及方差分析結(jié)果可知，液固比表現(xiàn)為曲線較陡，說明對明綠豆SOD比活力的影響最為顯著，液固比最佳值在22∶1（mL/g）左右，而超聲水浴溫度表現(xiàn)為曲線較為平滑，磷酸鹽緩沖液pH值次之，它們的最佳值分別在44 ℃和7左右。

2.3.2 模型的驗證

通過回歸模型預(yù)測的明綠豆SOD最佳提取工藝參數(shù)為：液固比22.27∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH6.94、超聲水浴溫度44.47 ℃。在此條件下，明綠豆SOD比活力理論上可達(dá)到855.67 U/mg?？紤]到實際操作的可行性，將明綠豆的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為：液固比22∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH 7、超聲水浴溫度44 ℃。

在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行驗證實驗，共進(jìn)行4次實驗。驗證實驗平均值為856.95 U/mg，理論值與實驗值的相對偏差為0.15%。說明采用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化明綠豆SOD提取條件是可行的，所得SOD提取條件具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié) 論

經(jīng)過Plackett-Burman試驗及響應(yīng)面分析法優(yōu)化，明綠豆SOD提取的最佳工藝參數(shù)為：液固比22∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH 7、超聲功率140 W、超聲時間20 min、超聲水浴溫度44 ℃、水浴浸提時間1.5 h、水浴浸提溫度60 ℃。此時明綠豆SOD的實際比活力為856.95 U/mg。不同來源SOD的比活力有所不同，已有的研究發(fā)現(xiàn)馬血、鴨血中SOD比活力為77.5[22]、 1 000.91 U/mg[23]；番茄、沙棘、仙人掌中SOD活力分別為55.5[24]、64.94[25]、215 U/mL[26]；紅酵母、啤酒廢酵母中SOD比活力達(dá)199.59[27]、31.75 U/mg[28]。與上述結(jié)果相比，除鴨血外，明綠豆中的SOD比活力均遠(yuǎn)高于其他來源的SOD比活力，說明利用明綠豆提取SOD是可行的，明綠豆可以成為一種新的植物SOD源。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of SOD from “Ming” Mung Bean by Plackett-Burman Design and Response Surface Methodology

LI Meiqing1,2, ZHANG Yu1, DAI Leili1, KONG Xianglin1, DU Xiaomei1
(1. School of Tea and Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Institute of Hefei Agricultural Products Processing, Hefei 230036, China)

An optimized ultrasonic-assisted procedure was proposed for the exhaustive extraction of superoxide dismutase (SOD) from “Ming” mung bean, a famous cultivar in Mingguang, Anhui province. Seven operating parameters were screened for their effects on the specifi c activity of SOD using Plackett-Burman design, and solvent-to-solid ratio, phosphate buffer pH and ultrasonic-waterbath temperature were identifi ed as the most signifi cant variables. Subsequently, the levels of the three variables were optimized by response surface methodology. The optimal extraction conditions for SOD were determined as phosphate buffer at pH 7 as the extraction solvent with a solvent-to-solid ratio of 22:1 (mL/g), waterbath extraction at 44 ℃ with an ultrasonic power of 140 W for 20 min and subsequently at 60 ℃ for additional 1.5 h without ultrasonication. Under these conditions, the specifi c activity of SOD was 856.95 U/mg. “Ming” mung bean as a new source of SOD contained more abundant SOD when compared with the traditional sources.

“Ming” mung bean; SOD; ultrasonic-assisted extraction; Plackett-Burman design; response surface methodology

R284.2

A

1002-6630（2015）02-0069-06

10.7506/spkx1002-6630-201502013

2014-06-30

合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院資助院企合作項目（2012HAPP002）

李梅青（1965—），女，副教授，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：lmq@ahau.edu.cn