穰杰+李莉+唐瓊+楊琦+何戀+丁學知+夏立秋

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31370116）;國家“973”基礎(chǔ)研究計劃資助項目（2012CB722301）;國家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計劃資助項目（2011AA10A203）;湖南省教育廳重點資助項目（13CY002， 10CY013，12K033）;湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目（20134486）

*通訊作者，Email：xialq@hunnu.edu.cn（湖南師范大學生命科學學院，微生物分子生物學國家重點實驗室培育基地，中國 長沙410081）

摘要為篩選有效提取細菌菌株總DNA的方法，分別采用SDS法、CTABSDS法、試劑盒法和改良試劑盒法對蘇云金芽胞桿菌、粘細菌和放線菌進行總DNA的提取、電泳檢測、NanoDrop 2000測定、PCR擴增.對放線菌和蘇云金芽胞桿菌，用改良試劑盒法所提取的總DNA純度較高，電泳條帶清晰，DNA主帶位于23 kb，單位體積菌液所提取到的總DNA較SDS法和CTABSDS法高，能滿足下游的PCR擴增等分子操作.對待測樣品所做的質(zhì)檢報告也證實樣品合格，可用于后續(xù)建庫、測序.而粘細菌提取到的總DNA由于它們的OD260/230在2.0以下，沒有達到第三代測序樣品的要求.改良試劑盒法所提取到的總DNA大多數(shù)可以滿足第三代測序技術(shù)樣品制備的要求.

關(guān)鍵詞第三代測序技術(shù);DNA提取方法;CTABSDS法;改良溶液型試劑盒法

中圖分類號Q939.9文獻標識碼A文章編號10002537（2015）06001407

Comparative Study of Bacterial DNA Extraction Methods

for the Third Generation Sequencing Technology

RANG Jie， LI Li， TANG Qiong， YANG Qi， HE Lian， DING Xuezhi， XIA Liqiu*

（College of Life Sciences， Hunan Normal University，

State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology， Changsha 410081， China）

AbstractTo screen the methods for effectivly extracting bacterial genomic DNA to the genome sequencing sample preparation for the third generation sequencing. The sodium dodecyl sulphate（SDS） extraction method， hexadecyltrimethylammonium bromidesodium dodecyl sulphate（CTABSDS） extraction method， genomic DNA kit extraction method and improved genomic DNA kit extraction method were compared to extract the total DNA from the Bacillus thuringiensis， Myxobacteria and Actinomycetes. Then， the DNA samples were evaluated through the agarose gelelectrophoresis， NanoDrop 2000 analysis， and PCR amplification， respectively. On Actinomycetes and Bacillus thuringiensis， the method based on improved genomic DNA kit extraction could obtain the higher purity DNA. The electrophoretic bands were clear， and main strip was located in the 23 kb. The total DNA content per unit volume extracted is much higher than SDS method and CTABSDS method， which could meet the need of downstream molecular application. The quality inspection report also confirmed the samples qualified， might be used for subsequent library construction and sequencing. However， the myxobateria total DNA extracted can not meet the requirements for the third sequencing sample because of their OD260/360 far below 2.0. The total DNA improved by genomic DNA kit extraction method could fulfill the sequencing technology requirements.

Key wordsThe third sequencing technology; DNA extraction method; CTABSDS method; improved solution genomic DNA kit extraction method

細菌全基因組測序在當今生命科學領(lǐng)域研究中具有非常重要的作用，其測序方法也由早先的Sanger雙脫氧法經(jīng)過第二代高通量測序技術(shù)，更新?lián)Q代為單分子熒光實時測序技術(shù)（SelfMonitoring Analysis and Reporting Technology，SMART技術(shù)）.該測序方法與第二代測序方法相比展示了無與倫比的優(yōu)勢.例如，第二代測序技術(shù)讀長較短，對后續(xù)的序列拼接、組裝以及注釋等生物信息學分析帶來困難，而且該技術(shù)建立在PCR的基礎(chǔ)上，所有影響PCR進行的因素（如GC值異常等）都會影響到全基因組測序，這些不足在一定程度上制約了第二代測序技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展[13].而第三代測序技術(shù)因其采用單分子讀取技術(shù)，數(shù)據(jù)讀取速度更快，其測序讀長也已達到10 kb，降低后續(xù)生物信息學分析所帶來的困難[4].同時不需要PCR擴增步驟，解除特殊基因組因GC含量的問題無法全部測序的限制，因此這種方法可以檢測基因組的原始狀態(tài)，獲得更真實的信息[56].此外，SMART技術(shù)還可以對基因組進行特殊分析，如甲基化研究、基因突變鑒定、RNA測序、重復序列和poly結(jié)構(gòu)的測序[711].

雖然SMART技術(shù)具有其他測序技術(shù)所無法比擬的優(yōu)勢，但是它卻對樣本DNA的質(zhì)量有更高的要求.其主要的參考指標有3個：基因組DNA電泳主條帶明顯且≥23 kb;無明顯降解和拖尾現(xiàn)象;OD260/280為1.8～2.0，OD260/230為2.0～2.2.與第二代測序不同的是，SMART測序技術(shù)還要考慮OD260/230的比值，因為SMART測序技術(shù)是邊合成邊測序的過程，該過程使用了DNA聚合酶，為了獲得讀長較長的片段的信息，需要維持DNA聚合酶的穩(wěn)定性，因此需要盡可能地去掉樣品中含有的鹽、有機溶劑和其他雜質(zhì)[6].

目前，國內(nèi)外許多學者對各種環(huán)境微生物多樣性進行了研究，建立了各種細菌總DNA提取方法，為提取不同細菌的總DNA提供了參考[6， 12].本研究分別采用SDS法[13]、CTABSDS法[6]、溶液型試劑盒法和改良溶液型試劑盒法對放線菌、蘇云金芽胞桿菌和粘細菌進行總DNA的提取，然后對其進行瓊脂糖凝膠電泳檢測、NanoDrop 2000紫外分光光度計測定.同時設(shè)計16S rDNA引物進行PCR擴增，比較PCR產(chǎn)物條帶的亮度和特異性.通過實驗比較，探索一種能均衡地從細菌中提取高質(zhì)量基因組DNA的方法，為第三代測序樣品的制備及下游的PCR擴增等分子操作奠定基礎(chǔ).

湖南師范大學自然科學學報第38卷第6期穰杰等：第三代測序細菌基因組DNA提取方法的比較1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株本研究所使用的3種菌株如表1所示.

表1供試菌株特性

Tab.1The properties of three strains used in this work

StrainCharacteristicsSourceBacillus thuringiensis 4.0718Bacterium，G+，rhabditiformLab storedMyxobacteria XT2Bacterium，G-，rhabditiform，orangeLab storedActinomycetes YActinomycetes，G+，branching filamentsLab stored1.1.2試劑細菌基因組快速提取試劑盒（溶液型）購自生工生物工程（上海）有限公司;EDTA（乙二胺四乙酸），SDS（十二烷基硫酸鈉），CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），乙酸鉀，瓊脂糖等均購自格林生物科技（長沙）股份有限公司;RNaseA酶，蛋白酶K，DNA相對分子質(zhì)量標記DL2000，λ DNA/Hind Ⅲ，PCR試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑.

1.1.3主要儀器設(shè)備NanoDrop 2000紫外分光光度計（Thermo Scientific公司），Gel Logic 200凝膠成像系統(tǒng)（柯達公司），Veriti 96 well thermal cycler PCR擴增儀（Applied Biosystems公司），Eppendorf 5415R型臺式離心機（德國Eppendorf公司），BioRad powerpac Basic電泳儀（BioRad公司），HZQF160全溫振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)公司），F(xiàn)3HN00200D型超純水儀（Millipore公司），DK98Ⅱ電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特公司）.

1.1.4培養(yǎng)基LuriaBertani 培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2）;TSB培養(yǎng)基（TSB 30 g/L，葡萄糖9 g/L，酵母粉3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，pH 7.2）;Amb培養(yǎng)基（Starch 5 g/L，Tryptone 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4 0.25 g/L，pH 6.8）

1.2方法

1.2.1細菌培養(yǎng)及預(yù)處理蘇云金芽胞桿菌菌株于30 ℃環(huán)境中200 r/min過夜，按1%～2%的體積比接種于含有20 mL LuriaBertani培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃環(huán)境中200 r/min培養(yǎng)2～3 h，然后取1 mL菌液分裝于1.5 mL的EP管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清，備用.

放線菌于30 ℃環(huán)境中280 r/min培養(yǎng)48 h，按10%的體積比接種于含有50 mL TSB培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃環(huán)境中280 r/min培養(yǎng)36 h，然后取1 mL菌液分裝于1.5 mL的EP管中，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，備用.

粘細菌菌株于30 ℃環(huán)境中160 r/min培養(yǎng)48 h，活化，按10%的體積比接種于含有50 mL Amb培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃環(huán)境中160 r/min培養(yǎng)84 h，然后取1 mL菌液分裝于1.5 mL的EP管中，8 000 r/min，離心5 min，棄上清，備用.

1.2.2細菌基因組試劑盒提?。ㄈ芤盒停┎僮鬟^程按照說明書進行.

1.2.3改良試劑盒提?。ㄈ芤盒停悠奉A(yù)處理后，進行基因組DNA的提取.（1）每個EP管中加入20 g/L的溶菌酶200 μL，37 ℃振蕩溫育30 min.（2）加入400 μL Buffer digestion， 6 μL蛋白酶K（終質(zhì)量濃度200 mg/L），65 ℃孵育1 h（孵育期間振蕩幾次效果會更好）.（3）在上述溶液中加入RNaseA（終質(zhì)量濃度50 mg/L），于37 ℃水浴鍋孵浴30 min.然后加入200 μL Buffer PB，振蕩混勻，-20 ℃冰箱放置5 min.（4）12 000 r/min離心5 min，取上清于一新的EP管中，約600 μL，勿吸入沉淀.（5）加入等體積的異丙醇于EP管中，搖勻，這時溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物，伴隨有黏度很高的液體.（6）用玻璃棒或槍頭將白色絲狀物挑取到另一裝有700 μL異丙醇的EP管中，顛倒幾次，靜置5 min，12 000 r/min離心2 min，棄上清，這時管底會出現(xiàn)淡黃色或略帶有白色的沉淀，此即為DNA.（7）取700 μL 預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心2 min，棄上清，重復此步驟一次.（8）待乙醇揮發(fā)干凈后，取適量體積不含EDTA的TE緩沖液溶解DNA（可視情況65 ℃預(yù)熱5 min，促使DNA溶解），備用.

1.2.4SDS提取參照文獻[13～14]有改進，樣品預(yù)處理后，進行基因組DNA的提取.步驟：（1）每個EP管中加入20 g/L的溶菌酶200 μL，37 ℃振蕩孵育30 min.（2）加入2 μL蛋白酶K（終質(zhì)量濃度為200 mg/L）， 20 μL RNaseA（終質(zhì)量濃度為50 mg/L），56 ℃孵育1 h（孵育期間振蕩幾次效果會更好）.（3）加入24.7 μL 20%的SDS（終體積分數(shù)為2%），65 ℃水浴2 h.（4）冰上冷卻后，加入等體積3 mol/L的醋酸鉀（pH 50），顛倒振蕩數(shù)次后冰上靜置10 min，12 000 r/min離心10 min， 取上清于新的EP管中.（5）加入等體積的氯仿和戊二醛混合液（V氯仿∶V戊二醛=24∶1），充分振蕩混勻，12 000 r/min 離心10 min，取上清于一新的EP管中，重復一次.（6）上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，12 000 r/min 離心2 min，倒上清.（7）取700 μL 預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心2 min， 棄上清，重復此步驟一次.（8）待乙醇揮發(fā)后，取適量體積不含EDTA的TE緩沖液溶解DNA（可視情況65 ℃預(yù)熱5 min，促使DNA溶解），備用.

1.2.5CTABSDS提取參照文獻[6]有改進，樣品預(yù)處理后，進行基因組DNA的提取.步驟：（1）每個EP管中加入20 g/L的溶菌酶200 μL，37 ℃振蕩溫育30 min.（2）加入2 μL蛋白酶K（終質(zhì)量濃度為200 mg/L）， 20 μL RNaseA（終質(zhì)量濃度為50 mg/L），56 ℃孵育1 h（孵育期間振蕩幾次效果會更好）.（3）加入24.7 μL 20%的SDS（終體積分數(shù)為2%），65 ℃水浴2 h.（4）6 000 r/min 離心5 min棄沉淀，量上清液體積， 加1/5倍體積的 5×CTAB， 65 ℃繼續(xù)恒溫水浴10 min.冷卻后加等體積的氯仿和異戊醇混合液（V氯仿∶V異戊醇=24∶1）， 緩慢倒轉(zhuǎn)離心管使溶液成為乳狀并保持幾分鐘.6 000 r/min離心10 min， 上清液移入另一離心管， 棄蛋白沉淀.重復用氯仿和異戊醇混合液抽提并離心，直到界面清晰為止.（5）上清液移至另一離心管，并加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，12 000 r/min 離心2 min，棄上清.（6）取700 μL 預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心2 min，棄上清，重復此步驟一次.（7）待乙醇揮發(fā)后，取適量體積不含EDTA的TE緩沖液溶解DNA（可視情況65 ℃預(yù)熱5 min，促使DNA溶解），備用.

1.2.6PCR擴增本研究旨在進行第三代基因組測序樣品提取方法比較，故只選擇其中一種菌進行PCR驗證.以所提取的Actinomycetes Y總DNA為模板，在Veriti 96 well thermal cycler PCR擴增儀上進行16S rRNA基因擴增，所用引物為根據(jù)E.coli 16S rRNA基因第8～27位堿基和1510～1492位堿基序列設(shè)計的原核生物16S rRNA PCR通用引物（F16：5′ agagtttgatcctggctcag3′; R16：5′acggctaccttgttacgactt3′）[15]，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

PCR擴增體系反應(yīng)體系（20 μL）： DNA模板，0.6 μL; 10×buffer，2 μL; dNTP Mix， 1.6 μL; F16（10 μmol）， 0.6 μL; R16（10 μmol），0.6 μL; Taq酶， 0.2 μL; ddH2O， 14.4 μL.

PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94 ℃，5 min; 變性94 ℃，30 s; 退火57 ℃， 30 s; 延伸72 ℃， 1 min 50 s; 30個循環(huán)后，72 ℃保溫10 min.

1.2.7DNA檢測基因組DNA用0.7%的瓊脂糖凝膠以75 V電壓電泳1 h，PCR擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠以100 V電壓電泳30 min，溴化乙錠（EB）染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相.基因組DNA使用Nano Drop 2000紫外分光光度計進行檢測，并計算OD260/280，OD260/230的數(shù)值.

2結(jié)果與分析

2.14種方法提取的3種不同細菌DNA總量和純度分析

從表2、表3和表4結(jié)果可知，本次研究使用4種提取細菌總DNA方法，所提取的細菌總DNA樣品OD260/280均在1.8～2.0，表明提取的總DNA純度較高，蛋白質(zhì)和RNA的污染極低.而在3種細菌總DNA樣品OD260/230分析時，作者發(fā)現(xiàn)對于放線菌和蘇云金芽胞桿菌，采用試劑盒法提取的總DNA樣品其OD260/230無法處于2.0～2.2，其他提取方法所提取到的總DNA樣品能夠滿足測序樣品純度的要求，這說明該基因組試劑盒在去除鹽等小分子物質(zhì)方面效果并不是很好.相反，對于粘細菌，4種提取方法所提取到的總DNA都無法使OD260/230處于2.0～2.2，這說明粘細菌總DNA在提取過程中可能有某些小分子無法通過常規(guī)的方法進行純化，導致A230有很大的吸收值，結(jié)果使得OD260/230偏低.

表24種方法提取放線菌總DNA純度與產(chǎn)量的比較

Tab.2The comparison of purity and yield for Actinomycetes Y total DNA extracted by four kinds of methods

MethodsOD260/280 OD260/280OD260/230 OD260/230Total/μg1.801.7383.73Genomic DNA kit extraction1.921.861.831.7956.051.861.8146.961.852.1056.19Improved genomic DNA kit extraction1.971.902.012.0780.381.882.1054.641.932.0525.301.951.932.002.0539.84SDS extraction1.902.1027.281.922.0935.34SDSCTAB extraction1.931.922.162.1128.191.912.0934.30

表34種方法提取蘇云金芽胞桿菌 4.0718 DNA純度與產(chǎn)量的比較

Tab.3The comparison of purity and yield for B. thuringiensis 4.0718 total DNA extracted by four kinds of methods

MethodsOD260/280 OD260/280OD260/230 OD260/230Total/μg1.822.3021.81Genomic DNA kit extraction1.811.842.232.2623.521.882.2618.481.822.0621.30Improved genomic DNA kit extraction1.811.812.062.0416.231.812.0121.181.992.129.12SDS extraction1.951.912.142.088.361.801.988.121.872.179.16SDSCTAB extraction2.01.922.172.149.121.902.099.56表44種方法提取粘細菌XT2 DNA純度與產(chǎn)量的比較

Tab.4The comparison of purity and yield for myxobacterium XT2 total DNA extracted by four kinds of methods

MethodsOD260/280 OD260/280OD260/230 OD260/230Total/μg1.891.7917.40Genomic DNA kit extraction1.881.861.861.8517.561.811.8915.921.871.6618.30Improved genomic DNA kit extraction1.951.881.821.7419.801.821.7317.501.971.7012.17SDS extraction1.961.971.621.659.101.991.6313.021.951.718.41SDSCTAB extraction1.931.951.561.6314.871.981.6210.78就單位體積提取到的基因組產(chǎn)量來說，使用試劑盒法和改良的試劑盒法明顯比其他兩種方法提取的總DNA的量多得多，如表2、表3和表4所示.結(jié)合DNA純度和單位產(chǎn)量這兩個指標進行分析，可以得出結(jié)論，改良試劑盒法在進行第三代基因組DNA樣品提取時具有明顯的優(yōu)勢.

2.23種細菌基因組總DNA的電泳檢測

分別采用溶液型試劑盒、改良溶液型試劑盒、SDS和CTABSDS方法對蘇云金芽胞桿菌、粘細菌和放線菌提取的總DNA用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，點樣量為100 ng，λDNA/Hind Ⅲ DNA Marker 3 μL.凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1、圖2和圖3.

M：λDNA/Hind Ⅲ DNA Marker; 1， 2， 3， 4：Total DNA of Actinomycetes Y by DNA kit extraction， improved DNA kit extraction， SDS extraction and CTABSDS extraction， respectively.

圖1不同方法提取放線菌總DNA的電泳

Fig.1Electrophoresis of Actinomycetes Y total DNA for different extraction methodsM：λDNA/Hind Ⅲ DNA Marker; 1， 2， 3， 4：Total DNA of B. thuringiensis strain by DNA kit extraction， improved DNA kit extraction， SDS extraction and CTABSDS extraction， respectively.