茶多酚對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫調(diào)節(jié)作用研究

李 靜，陳永順，梁建梅，蔣建平，賈曉棟

(1.商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 商丘 476100;2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧 530021)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜炎癥、骨骼和軟骨破壞及滑膜組織增殖為特征的自身免疫性疾病，極易致殘，研究顯示，炎性因子、細(xì)胞因子和促炎因子等在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病及進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用，但是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其病因及發(fā)病機(jī)理闡述迄今尚未完全明確［1-4］。RA作為一種臨床常見疾病，可在任何年齡階段發(fā)病，以中年女性較多。據(jù)統(tǒng)計，在我國類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者有近1 000萬［5-6］。本實驗以Ⅱ型膠原乳化劑誘導(dǎo)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，通過測量大鼠足趾容積，分析大鼠免疫器官胸腺和脾臟指數(shù)，酶聯(lián)免疫法檢測大鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α的表達(dá)水平，分析上述指標(biāo)與RA的相關(guān)性，從免疫的角度探討茶多酚對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用，為其進(jìn)一步的研究開發(fā)提供實驗和理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要試劑 雞Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑(Sigma公司)，茶多酚(西安瑞林生物，純度≥98%，醫(yī)藥食品級)，地塞米松片(河南新鄉(xiāng)常樂制藥公司)，IL-6、TNF-α檢測試劑盒(南京建成生物公司)。

1.2 主要儀器 電子天平JA2003(上海精密儀器廠)，足趾容積測量儀(北京凱云儀有限公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Rad)。

1.3 實驗動物 SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體重(160±20)g，由商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實驗動物中心提供(許可證號SQYZ-2014-A05)。

2 方法

2.1 膠原乳化劑的制備 取雞Ⅱ型膠原蛋白10 mg，加入 0.1 mol·L-1醋酸 5 mL，充分溶解，配成 2 g·L-1溶液，4℃過夜，備用。取弗氏完全佐劑5 mL，膠原5 mL溶液混合，制成膠原乳化液，4℃冷藏備用。

2.2 試驗設(shè)計

2.2.1 分組 大鼠40只隨機(jī)分為4組:空白組(正常空白對照組)、模型組(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型對照組)、地塞米松組(地塞米松對照組)、茶多酚組(茶多酚治療組)。

2.2.2 模型建立及處置 空白組大鼠右后足墊皮內(nèi)注射生理鹽水0.1 mL，其余各組大鼠注射膠原乳化劑0.1 mL。1周后相同劑量于尾根部皮內(nèi)注射加強(qiáng)免疫1次。加強(qiáng)免疫后次日，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，茶多酚治療組大鼠每天灌胃茶多酚200 mg·kg-1，地塞米松對照組每天灌胃地塞米松 2 mg·kg-1，持續(xù) 21 d。

2.2.3 觀測項目 分別在治療的第1、7、14、21天測量大鼠體重和使用足跖容積測量儀測量大鼠右后足跖容積，計算足跖腫脹率，腫脹率(%)=致炎前后足跖容積之差/致炎前的足跖容積×100%。

2.3 指標(biāo)檢測 給藥結(jié)束后，測量記錄各組大鼠體重，測量大鼠足趾體積。處死大鼠，取血清，嚴(yán)格按照試劑盒的說明，ELISA法檢測大鼠血清IL-6、TNF-α水平;取胸腺和脾臟計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/動物體重(g)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。觀測資料中的計量數(shù)據(jù)，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述之，均行正態(tài)性檢驗。多組間的比較為單因素方差分析，組間兩兩比較為LSD法;多組多時點的觀測資料則行兩因素重復(fù)測量方差分析;其它計數(shù)資料，多組間的比較為整體+分割卡方檢驗。顯著性水準(zhǔn) α =0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠飲食和體重的變化 各組受試大鼠各時點體重數(shù)據(jù)列于表1。經(jīng)兩因素重復(fù)測量方差分析:整體看組間差異不顯著，時點間的變化、分組和時間的交互作用均有顯著性意義(P＜0.05)。遂繼續(xù)進(jìn)行精細(xì)比較，并結(jié)合觀測現(xiàn)象來看:空白組大鼠精神好，飲食好，活潑，其余各組大鼠約從造模第5天開始，食欲不振。分別給予地塞米松、茶多酚后，大鼠飲食有改善，體重增長有所加速，在第21天，與模型組大鼠體重比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果詳見表1。

表1 大鼠體重資料比較(g，n=10，±s)

表1 大鼠體重資料比較(g，n=10，±s)

注:兩因素重復(fù)測量方差分析，空白組不加入分析。

A1:茶多酚組 A2:地塞米松組 A3:模型組 A4:空白組T1:1 d 173.5 ±16.9 175.7 ±16.6 174.5 ±14.1 176.5 ±14.2 T2:7 d 182.6 ±19.3 179.1 ±20.4 171.2 ±16.2 183.5 ±17.5 T3:14 d 187.2 ±16.3 189.5 ±13.7 176.7 ±14.3 192.8 ±21.7 T4:21 d 193.2 ±21.7 194.5 ±16.9 180.3 ±14.5 200.2 ±17.3整體分析F，P (HF系數(shù):0.8012)組間比較 0.172，0.843時點間比較 3.207，0.047組 × 時點 9.084，0.000組間比較t，P A1 vs A2 A1 vs A3 A2 vs A3 T1 0.590，0.562 0.439，0.666 0.238，0.815 T2 0.906，0.377 0.804，0.432 2.062，0.054 T3 1.840，0.082 0.489，0.631 1.242，0.230 T4 0.592，0.561 2.198，0.044 2.530，0.021時點比較t，P A1 A2 A3 T2 vs T1 1.386，0.199 1.531，0.160 0.040，0.969 T3 vs T1 1.826，0.101 0.656，0.528 1.017，0.336 T4 vs T1 0.289，0.779 0.983，0.351 2.410，0.039

3.2 茶多酚對大鼠足趾腫脹的影響 各組大鼠足趾腫脹率資料列于表2。顯然，腫脹率最低的為空白組，其次為地塞米松組。經(jīng)整體+分割卡方檢驗，第14及21天時，茶多酚組、地塞米松組及模型組等3組間的整體差異顯著(P＜0.05)。結(jié)合兩兩組間比較及實驗觀測情況來看:空白組足趾無明顯腫脹。模型組大鼠右后足趾腫脹明顯，足墊增厚，活動明顯受限，而地塞米松對照組及茶多酚治療組大鼠右后足踝腫脹明顯減輕、活動能力較模型組大鼠有所增強(qiáng)，見表2。

表2 大鼠足趾腫脹率資料比較/%

3.3 茶多酚對大鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響 各組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)的資料列于表3。經(jīng)對茶多酚組、地塞米松組及模型組等3個組的資料做單因素方差分析，整體比較均為顯著(P＜0.05)。兩兩比較并結(jié)合數(shù)據(jù)來看:模型組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)較空白組明顯升高，地塞米松對照組、茶多酚治療組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)較模型組明顯降低，與模型組比較有顯著差異(P＜0.05)。

表3 大鼠胸腺、脾臟指數(shù)比較(n=10)

3.4 茶多酚對大鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α水平的影響 各組大鼠血清的促炎因子IL-6、TNF-α水平數(shù)據(jù)列于表4。亦經(jīng)單因素方差分析，IL-6、TNF-α兩個指標(biāo)，茶多酚組、地塞米松組及模型組等3個組間的整體比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。各組之間的兩兩比較也多有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)合數(shù)據(jù)來看:給藥結(jié)束后，地塞米松對照組、茶多酚治療組大鼠血清IL-6、TNF-α水平明顯降低，與模型組比較，有較大的差別，詳見表4。

表4 大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 (n=10，μg·L-1)

4 討論

近年來，化學(xué)合成物中發(fā)現(xiàn)新藥的命中率明顯降低，創(chuàng)制成本越來越高，研制周期越來越長。以美國FDA為例，1996年和1997年分別批準(zhǔn)了120項以上的新藥申請;但2001年批準(zhǔn)的新藥申請數(shù)量減為66項，2009年為26項，2010年銳減為21項，加之化學(xué)合成藥物的毒副作用顯著，使越來越多的新藥研究人員把目光轉(zhuǎn)向天然活性產(chǎn)物及其衍生物［7-8］。另據(jù) 1995 年美國一項統(tǒng)計結(jié)果表明［9］，1984年到1995年間，美國使用的藥物中含天然活性產(chǎn)物及其衍生物的比例高達(dá)60%。因此，天然活性產(chǎn)物及其衍生物在藥物的研發(fā)及改良中將會發(fā)揮越來越重要的作用。

綠茶是世界上很熟知的且受人們喜愛的飲品，茶多酚是綠茶中的主要活性成分，是一類含有多羥基酚類化合物的總稱，含量約占茶葉干物質(zhì)總量的20%～30%。研究表明，茶多酚具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、調(diào)血脂、抗衰老、抗腫瘤等多種功效，引起廣泛關(guān)注［10-14］。

大量研究資料認(rèn)為，RA是在遺傳背景的基礎(chǔ)上，在環(huán)境因素的影響下，免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能紊亂，引起細(xì)胞因子失衡所致的炎癥反應(yīng)性疾?。?5-18］。IL-6作為前炎癥細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，在RA患者骨與軟骨破壞中起著重要作用，目前已開發(fā)IL-6受體抗體Tocilizumab用于RA的臨床治療。TNF-α是RA發(fā)病和維持關(guān)節(jié)滑膜炎癥的關(guān)鍵致炎性因子，可作用于RA關(guān)節(jié)組織中的滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，使這些細(xì)胞活化產(chǎn)生金屬蛋白酶、膠原酶等，導(dǎo)致滑膜炎癥反應(yīng)和血管翳形成，引起骨和軟骨破壞［19-20］。本研究結(jié)果顯示，茶多酚200 mg·kg-1每天給類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠灌胃，可增加大鼠飲食，大鼠體重增長明顯加快，與模型組比較P＜0.05;大鼠在給予茶多酚治療后，足跖腫脹明顯減輕，大鼠活動量明顯增加，說明茶多酚對CIA大鼠有一定治療作用。胸腺和脾臟是免疫系統(tǒng)的兩大重要臟器，測定大鼠臟器指數(shù)顯示，茶多酚可明顯降低CIA大鼠胸腺、脾臟指數(shù)(P＜0.05)，進(jìn)一步檢測大鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α水平顯示，茶多酚治療組明顯低于模型組(P＜0.05)，說明茶多酚對CIA大鼠紊亂的免疫系統(tǒng)有一定的抑制作用，推測其機(jī)理可能與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫細(xì)胞活性、抑制機(jī)體免疫細(xì)胞過度分泌IL-6、TNF-α引起炎癥反應(yīng)有關(guān)，這為深入研究茶多酚治療RA提供了新的思路。

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