響應(yīng)面法優(yōu)化重組大腸桿菌生物合成別藻藍蛋白(holo-apcA)的發(fā)酵條件

周孫林, 陳華新, 姜 鵬, 李富超, 唐東山,

(1.南華大學(xué) 污染控制與資源化湖南省高校重點實驗室, 湖南 衡陽 421000; 2.中國科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071; 3.南華大學(xué) 環(huán)境保護與安全工程學(xué)院, 湖南 衡陽 421001)

藻膽蛋白是藍藻、紅藻、隱藻和某些甲藻中特有的重要捕光色素蛋白, 由藻膽色素與脫輔基蛋白共價結(jié)合而成, 具有增強人體免疫力、抗氧化和抗腫瘤作用, 并可用作食品天然色素。藻膽蛋白具有熒光特性, 在免疫組化、熒光免疫分析等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。別藻藍蛋白是藻膽蛋白中的一種, 目前大多提取自各種藻類, 但天然別藻藍蛋白的制備需要經(jīng)過藻種選育、培養(yǎng)、回收與純化等過程, 時間及經(jīng)濟成本大, 且得到的蛋白穩(wěn)定性不高, 因此市面價格極高, 很大程度上限制了它的廣泛應(yīng)用。

利用代謝工程的方法實現(xiàn)別藻藍蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的生物合成[1], 為藻膽蛋白的制備提供了一種新的途徑[1-4]。本實驗室將嗜熱藍藻(Synechococcus elongatusBP-1)的別藻藍蛋白 α亞基基因插入載體pCDFDuet-1第一表達框內(nèi), 同時將催化合成藻藍膽素的亞鐵血紅素氧化酶基因Ho1和膽綠素還原酶基因PcyA插入載體pCDFDuet-1第二表達框內(nèi), 得到質(zhì)粒 pCDF-apcA-Ho1-PcyA; 并將催化色基與 apcA共價結(jié)合的裂合酶基因CpcS和CpcU插入載體pRSFDuet-1第二表達框內(nèi), 得到質(zhì)粒 pRSF-cpcS-cpcU。將上述質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 利用大腸桿菌本身具有亞鐵血紅素這一特性, 實現(xiàn)了重組別藻藍蛋白α亞基的體內(nèi)重組[2]。與天然別藻藍蛋白相比, 它具有結(jié)構(gòu)單一, 理化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點。大腸桿菌中生物合成別藻藍蛋白受多種因素影響, 張偉杰等[5]對重組別藻藍蛋白誘導(dǎo)條件進行了優(yōu)化, 但上述試驗中利用的優(yōu)化方法均為單因素試驗, 即單次單因子法(One-factor-at-a-time design), 這種方法是在假設(shè)因素間不存在交互作用的前提下, 一次改變一個因素的水平而其他因素保持不變, 對每個因素逐一考察。這種方法的優(yōu)點是簡單、結(jié)果明了, 不需要專門的統(tǒng)計學(xué)知識, 因此一直都是條件優(yōu)化的常用方法。但是由于作者通?？疾斓膶嶒炓蛩亻g存在一定的交互作用, 該方法得出的結(jié)果無法全面的說明各因素與響應(yīng)值之間的復(fù)雜關(guān)系, 且當考察的因素較多時,需要試驗次數(shù)多和試驗周期長, 因此單因素法在條件優(yōu)化過程中常常用于初步的篩選試驗[6-9]。

本試驗利用響應(yīng)面中心組合設(shè)計試驗方法對誘導(dǎo)條件進行了進一步優(yōu)化, 響應(yīng)面設(shè)計法(Responsesurface methodology, RSM)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法, 是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計方法結(jié)合的產(chǎn)物, 它可以用來對受多個變量影響的響應(yīng)問題進行建模與分析, 并可以將該響應(yīng)進行優(yōu)化。該法不但具備試驗次數(shù)少, 周期短、精度高等優(yōu)點, 而且可以建立連續(xù)變量曲面模型, 同時對影響試驗指標的各因子水平及其交互作用進行優(yōu)化和評價, 可快速有效的確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[6,9-10]。

試驗利用中心組合設(shè)計對重組別藻藍蛋白 α亞基表達體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達的影響因素進行了影響顯著性及各因素間交互性考察, 通過驗證試驗比較, 證實了優(yōu)化條件下誘導(dǎo)得到的同體積表達量是未優(yōu)化條件的2.3倍, 驗證試驗結(jié)果與優(yōu)化試驗預(yù)測值相符。該誘導(dǎo)結(jié)果與以往文獻[12]報道結(jié)果相比提高了70 %~580 %, 且IPTG使用濃度經(jīng)優(yōu)化后減少至原使用濃度的十分之一, 為文獻[12]報道使用濃度(IPTG 0.5 mM)的五分之一, 降低了發(fā)酵成本。試驗證明響應(yīng)面法-中心組合設(shè)計對重組別藻藍蛋白α亞基的誘導(dǎo)條件優(yōu)化確實可行。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和試劑

菌株: 基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pCDF-apcA-Ho1-pcyA/pRSF-cpcU-cpcS 由中國科學(xué)院海洋研究所構(gòu)建, 含有別藻藍蛋白 α亞基生物合成相關(guān)的5個基因。

活化菌種所用培養(yǎng)基: LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L, NaCl 10 g/L; pH值7.4)

誘導(dǎo)所用培養(yǎng)基: TB培養(yǎng)基(蛋白胨12 g/L, 酵母粉12 g/L, 磷酸鹽緩沖液(72 mmol/L K2HPO4; 17 mmol/L KH2PO4), 甘油 4 ‰)

試劑: 酵母粉和蛋白胨購自O(shè)xoid公司, 卡那霉素, 壯觀霉素和IPTG購自Solarbio公司, 其他試劑購自國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 響應(yīng)面(RSM)因素水平

根據(jù)以往文獻報道試驗結(jié)果[5]確定 4因素(誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時機、培養(yǎng)基初始pH、誘導(dǎo)劑IPTG終濃度)用于中心組合試驗設(shè)計作4因素5水平實驗設(shè)計, 共30組實驗, 其中中心點6組(用于評估隨機誤差對實驗結(jié)果造成的影響), 每組重復(fù) 3次平行試驗(共計90組實驗)。實驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 中心組合設(shè)計試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of central composition design

1.2.2 菌種的誘導(dǎo)表達

取保存的同等活力菌種按 0.5 %的接種量接種于加壯觀霉素 (100 μg/mL)和卡那霉素 (50 μg/mL)抗性的50 mL LB培養(yǎng)基中, 37 ℃ , 200 r /min回旋式搖床中培養(yǎng) 15 h。按 4%的接種量, 接種至不同 pH值的25 mL TB培養(yǎng)基中, 37 ℃劇烈振搖(200 r/min)不同時長, 再于超凈臺加入IPTG至不同終濃度, 在試驗設(shè)計的各自溫度下誘導(dǎo)相同時長(8 h)。

1.2.3 熒光強度的測定

使用熒光分光光度計 F-4500 (Hitachi, Japan)直接對誘導(dǎo)得到的菌液進行熒光值測定, 后對其進行數(shù)據(jù)處理。所設(shè)參數(shù)為掃描范圍600~700 nm, 在590 nm激發(fā)光波長下掃描其熒光發(fā)射光譜, 掃描速度240 nm/s,熒光最大值設(shè)為1000, 熒光值超過1000的樣品對菌體稀釋相應(yīng)倍數(shù)后測定, 記錄其熒光發(fā)射峰值及其峰值處的波長。

1.2.4 響應(yīng)面(CCD)分析法

預(yù)試驗中, 菌液熒光值 0~500 a.u.范圍內(nèi), 菌液熒光值與蛋白表達量呈線性關(guān)系, 即菌液經(jīng)離心破碎后得到重組熒光蛋白的表達量(mg/L)=(1.8×菌液熒光值-1.9513)/22.781。試驗中以菌液熒光值為響應(yīng)值, 反應(yīng)了不同因素對重組別藻藍蛋白表達量的影響。利用Design-Expert 8.0軟件建立多元二次回歸方程, 對方程進行模型回歸和方差分析, 確定別藻藍蛋白(holo-apcA)誘導(dǎo)表達的最佳條件, 分別以優(yōu)化條件和以往誘導(dǎo)條件進行驗證試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 中心組合設(shè)計試驗優(yōu)化重組別藻藍蛋白(holo-apcA)的發(fā)酵條件

2.1.1 響應(yīng)面法中心組合設(shè)計及試驗結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面法中心組合設(shè)計試驗設(shè)計原理作四因素 5水平試驗設(shè)計。中心組合設(shè)計及試驗結(jié)果見下表3。

利用Design-Expert 8.0軟件對表2中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合, 得到4因素A(誘導(dǎo)溫度)、B(發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH)、C(IPTG 終濃度)、D(誘導(dǎo)時機)與響應(yīng)值R之間的回歸方程為:

表2 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Coded and real values of variables in central composition design

表3 響應(yīng)面二次模型回歸方程的方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variances for full quadratic model

R=95.16+16.1A+15.08B-6.08C+31.40D+5.79AB-

2.1.2 回歸模型方差分析

利用Design expert 8.0軟件對響應(yīng)面二次模型回歸方程進行方差分析, 結(jié)果見表3和表4。

從表3可以看出, 該模型的F值為9.37,Prob>F值為<0.0001, 說明該模型極顯著, 僅有不到 0.01%的概率不能用該模型來解釋; 失擬項Prob>F=0.1637>0.05, 失擬不顯著, 說明回歸方程的擬合度較好; CV%= 29.84, 較低, 說明試驗操作可信; 預(yù)測R2值為0.8974, 校正后RAdj2= 0.8016, 說明該模型可以解釋89.74%的試驗所得的響應(yīng)值的變化。從表4可以看出, 影響因子A(誘導(dǎo)溫度)、B(pH)、D(誘導(dǎo)時機)的P值均小于0.05, 說明這3個因素對模型影響顯著, 其中D的P值<0.0001, 影響極顯著; 而C(IPTG終濃度)的P值=0.1766>0.05, 對模型的影響不顯著, 各因素對響應(yīng)值的影響順序為:D>A>B>C;且各因素間存在交互作用, 交互項AD的P值小于0.05, 影響顯著; 另外二次項A2、D2的P值也小于0.05, 影響顯著, 其中A2的P值<0.0001影響極顯著,其余項不顯著。交互項及二次項的顯著性進一步說明各影響因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系,不能單靠單因素試驗來進行優(yōu)化。

表4 各編碼因素水平方差分析Tab.4 Analysis of variances for holo-apcA production in coded level variables

2.1.3 響應(yīng)曲面分析

響應(yīng)曲面是在所考察的四因素中的任意兩因素水平固定的前提下, 以中心組合設(shè)計中的響應(yīng)值為縱坐標, 其他兩個因素分別為水平面上的兩垂直橫坐標所構(gòu)成的三維模型。模型中每個響應(yīng)面分別代表2個獨立變量之間的相互作用, 兩因素相互之間交互作用對響應(yīng)值的影響顯著的模型曲面呈馬鞍型,等高線呈橢圓形; 反之, 則模型曲面呈圓滑型, 等高線呈圓形。二次回歸方程的響應(yīng)面及等高線圖見圖1, 圖中由各響應(yīng)曲面及相應(yīng)的等高線可以看出, (a)圖誘導(dǎo)溫度與培養(yǎng)基初始pH之間以及(d)圖IPTG終濃度與培養(yǎng)基初始pH之間的交互作用均不顯著, 表現(xiàn)為響應(yīng)曲面圓滑, 變化平緩, 等高線呈圓形; 而其余圖(b, c, e, f)的兩因素間交互作用都比較明顯, 表現(xiàn)為曲面呈馬鞍型, 在靠近極值處響應(yīng)值驟變, 等高線呈橢圓形。

2.2 驗證試驗

根據(jù)得到的擬合方程, 可采用繪制出響應(yīng)面圖的方法獲得最優(yōu)值, 也可采用方程求解的方法獲得最優(yōu)值。本試驗中直接通過Design-Expert軟件在響應(yīng)曲面圖中得出重組別藻藍蛋白發(fā)酵的最佳條件為:誘導(dǎo)溫度28 ℃, 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 8.5, 加入IPTG的終濃度0.1 mmol/L, 誘導(dǎo)時機為菌體轉(zhuǎn)接后3 h。在此條件下軟件得出的回歸模型預(yù)測值為菌液熒光值269.5, 即蛋白表達量為21.2 mg/L。

為驗證模型預(yù)測的準確性及優(yōu)化方案的可行性,根據(jù)軟件得出的優(yōu)化方案進行了驗證試驗, 試驗重復(fù)3次, 取平均值。實測誘導(dǎo)得到的菌液熒光值258.7 au,即重組別藻藍蛋白表達量為20.4 mg/L, 與軟件預(yù)測值相對誤差為 4 %, 說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的模型與試驗數(shù)據(jù)擬合度較好, 達到了優(yōu)化重組別藻藍蛋白發(fā)酵條件的目的。

3 討論

藻膽蛋白作為藻類特有的重要捕光色素蛋白,在臨床醫(yī)學(xué)診斷和免疫組化等研究領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景, 因此, 近年來對于藻膽蛋白制備與應(yīng)用等相關(guān)研究較多。其中關(guān)于重組別藻膽蛋白在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達的試驗研究中, 包括了一部分對其誘導(dǎo)表達條件的探索及優(yōu)化試驗[5,11], 文獻報道的對重組別藻藍蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化方法一般采用單因素試驗, 該試驗方法忽略了試驗中因素間的交互作用, 得到的優(yōu)化條件不一定為最優(yōu)。因此,本試驗利用響應(yīng)面-中心組合設(shè)計試驗對重組別藻藍蛋白誘導(dǎo)表達條件進行了進一步的優(yōu)化。

通過 Design-expert 8.0軟件得出了各因素優(yōu)化值和優(yōu)化條件下的響應(yīng)值。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為: 誘導(dǎo)溫度28℃、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 8.5、誘導(dǎo)時機3 h、IPTG終濃度0.1 mmol/L, 在此條件下發(fā)酵得到的重組別藻藍蛋白(holo-apcA)表達量為20.4 mg/L, 與軟件預(yù)測值相對誤差為 4 %, 說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的模型與試驗數(shù)據(jù)擬合度較好, 達到了優(yōu)化重組別藻藍蛋白發(fā)酵條件的目的, 與優(yōu)化前本試驗原始誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)的結(jié)果(即表達量 9 mg/L)相比較, 蛋白表達量增加為原來的2.3倍, 與文獻報道的重組別藻藍蛋白α亞基蛋白表達量3~12 mg/L[12]相比較, 表達量提高了70 %~580 %。該發(fā)酵條件與原發(fā)酵條件相比主要不同在于發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH由原來的7.4增大到現(xiàn)在的8.5, IPTG使用終濃度由原來的1 mmol/L減少到現(xiàn)在的0.1 mmol/L。

圖1 各因素交互作用及其對別藻藍蛋白表達量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface curves and contour plot of factor interaction effecting on holo-apcA production

表5 最優(yōu)化發(fā)酵條件驗證試驗結(jié)果Table.5 Validation of the model

發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH對菌體的生長和產(chǎn)物的表達均存在一定的影響, 因為乙酸是大腸桿菌的主要副產(chǎn)物, 它對細菌生長和產(chǎn)物的表達都有抑制作用[13-15], 劉永軍等[16]通過試驗得到大腸桿菌的最適生長酸度為7.82, 較高的初始pH對菌體生長過程中產(chǎn)生的乙酸存在一定的調(diào)節(jié)作用, 促進菌體的生長與產(chǎn)物的表達。培養(yǎng)基的pH還將影響酶分子和底物分子的帶電狀況, 從而影響酶的合成, 使代謝和細胞透性發(fā)生變化[17]。分析pH的增加可能導(dǎo)致細胞膜通透性的增大, 從而有利于誘導(dǎo)劑IPTG進入到細胞內(nèi)部與阻遏蛋白結(jié)合, 起到誘導(dǎo)效果。由于IPTG是一種作用極強的誘導(dǎo)劑, 不被細菌代謝而十分穩(wěn)定,因此少量的 IPTG在較高通透性的細胞間可自由出入, 對多個細胞起到誘導(dǎo)作用。而由響應(yīng)面圖1可以看出, IPTG終濃度過高反而會導(dǎo)致表達量的減少,由于 IPTG對工程菌的生長有著明顯的抑制作用[18-19],菌體量不足固然導(dǎo)致蛋白表達量的降低。

通過響應(yīng)面模型分析得出影響因素A(誘導(dǎo)溫度)與D(誘導(dǎo)時機)間存在明顯的交互作用。交互作用是兩種或兩種以上因子的綜合效果[20], 在統(tǒng)計學(xué)上的定義為: 如果因素A的數(shù)值和水平發(fā)生變化, 試驗指標隨因素B變化的規(guī)律發(fā)生變化; 或反之, 若因素B的數(shù)值或水平發(fā)生變化時, 試驗指標隨因素A變化的規(guī)律也發(fā)生變化。AD(即誘導(dǎo)溫度和時機)的交互作用表現(xiàn)為:AD(即誘導(dǎo)溫度和時機)的交互作用表現(xiàn)為: 誘導(dǎo)時機隨著誘導(dǎo)溫度的上升而縮短,反之, 隨著誘導(dǎo)溫度的降低, 誘導(dǎo)時機則相應(yīng)延長。大腸桿菌生長最適溫度為37 ℃, 試驗得到蛋白表達的最適誘導(dǎo)溫度為 28 ℃, 最適誘導(dǎo)時機為 3 h, 由于誘導(dǎo)的最佳時機為菌體生長的對數(shù)期, 該階段菌體生長活性高, 菌體內(nèi)蛋白表達效率也高。若一定時長范圍(本試驗 1 ~3 h)內(nèi)菌體誘導(dǎo)時機(即誘導(dǎo)前培養(yǎng)時長)較長, 誘導(dǎo)前菌體生長則較接近對數(shù)期, 進入誘導(dǎo)階段后誘導(dǎo)溫度越高則菌體生長越快, 較高的誘導(dǎo)溫度使得菌體在原對數(shù)期的基礎(chǔ)上繼續(xù)快速繁殖, 菌液中由于菌體量的迅速增多使得營養(yǎng)物質(zhì)缺乏和代謝物堆積, 從而使菌體生長很快進入穩(wěn)定期, 菌體活性降低, 蛋白表達量從而受到影響; 且由于大腸桿菌體內(nèi)自身會合成一些蛋白酶, 酶在一定范圍內(nèi)溫度越高其活性越高, 發(fā)酵得到的蛋白在較高溫度下可能被蛋白酶部分降解, 從而降低了最終獲取蛋白量。若一定時長范圍(本試驗1 ~3 h)內(nèi)菌體誘導(dǎo)時機(即誘導(dǎo)前培養(yǎng)時長)較短, 誘導(dǎo)前菌體生長尚未達到對數(shù)期, 進入誘導(dǎo)階段后誘導(dǎo)溫度越高則菌體生長越快, 菌體在較適宜溫度下生長達到對數(shù)期, 在對數(shù)期維持一定時長后再進入穩(wěn)定期, 菌體在蛋白誘導(dǎo)表達過程中大部分時間停留在整個對數(shù)期內(nèi), 菌體活性高, 蛋白表達量高。

綜上所述, 利用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化重組別藻藍蛋白發(fā)酵條件不但提高了蛋白的表達量, 還減少了IPTG的用量, 降低了發(fā)酵成本。該試驗結(jié)果為重組大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵制備別藻藍蛋白提供了依據(jù)。

[1]Zhang W J, Guan X Y, Yang Y, et al.Biosynthesis of fluorescent allophycocyanin α-subunits by autocatalysis inEscherichia coli[J].Biotechnology and Applied Biochemistry, 2009, 52: 135-140.

[2]劉少芳.藍藻別藻藍蛋白的生物合成及組裝的研究[D].青島: 中國科學(xué)院海洋研究所, 2010.

[3]Ge B S H, Sun H X, Feng Y, et al.Functional biosynthesis of an allophycocyan beta subunit inEscherichia coli[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 107 (3): 246-249.

[4]Liu S H F, Chen Y J, Lu Y D, et al.Biosynthesis of fluorescent cyanobacterial allophycocyanin trimer inEscherichia coli[J].Photosynth Res, 2010, 105:135-142.

[5]張偉杰, 楊雨, 關(guān)翔宇, 等.產(chǎn)重組別藻藍蛋白類熒光蛋白的重組大腸桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].海洋科學(xué), 2009, 33(9): 57-61.

[6]代志凱, 張翠, 阮征.試驗設(shè)計和優(yōu)化及其在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報, 2010, 37(6):894-903.

[7]范洪臣, 李艷華, 梁金鐘, 等.響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌產(chǎn)γ-PGA的條件[J].生物加工過程, 2008, 6(3):17-23.

[8]田泱源, 李瑞芳.響應(yīng)面法在生物過程優(yōu)化中的應(yīng)用[J].食品工程, 2010, 2 (6): 8-11.

[9]劉建忠, 熊亞紅, 翁麗萍, 等.生物過程的優(yōu)化[J].中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2002, 41(Suppl): 132-137.

[10]He J, Zhen Q W, Qiu N, et al.Medium optimization for the production of a novel bioflocculant from Halomonas sp V3a′ using response surface methodology[J].Bioresource Technology, 2009, 100(23): 5922-5927.

[11]林凡, 秦松.乳糖誘導(dǎo)重組別藻藍蛋白基因在大腸桿菌中的表達[J].海洋科學(xué), 2005, 29(11): 22-27.

[12]Biswas A, Vasquez Y M, Dragomani T M, et al.Biosynthesis of cyanobacterial phycobiliproteins inEscherichia coli: chromophorylation efficiency and specificity of all bilin lyases fromSynechococcussp.Strain PCC 7002[J].Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(9): 2729-2739.

[13]Konstantinor K, Kishimoto M, Seki T, et al.A balanced DO-stat and its application to the control of acetic acid excretion by recombinantEscherichia coli[J].Biotech Bioeng, 1990, 36(7): 750-758.

[14]李民, 陳常慶.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵研究進展[J].生物工程進展, 2000, 20(2), 26-31.

[15]楊如燕, 李民, 陳常慶.重組大腸桿菌YK537/pSB-TK高密度培養(yǎng)過程中有機酸的 RP-HPLC快速分析[J].工業(yè)微生物, 1998, 28(3): 30-32.

[16]劉永軍, 劉英, 孫海濤, 等.微生物最適生長酸度的微量熱法研究[J].物理化學(xué)學(xué)報, 1997, 13(7):637-639.

[17]童群義, 陳堅.分批培養(yǎng)時 pH和溫度對重組大腸桿菌生產(chǎn)谷胱甘肽合成酶系的影響[J].工業(yè)微生物,2001, 31(4): 17-21.

[18]楊梅, 程安春, 汪銘書, 等.重組鴨 α-干擾素基因工程菌表達條件的研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007,25(3): 337-342.

[19]常國棟, 李壯林, 秦加陽, 等.重組人血管內(nèi)皮抑制素(rh.Endostatin)大腸桿菌表達體系發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].生物工程學(xué)報, 2005, 21(4): 662-665.

[20]葉紅衛(wèi).SPSS實現(xiàn)有交互作用的正交實驗設(shè)計[J].西安文理學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2009, 12(4):118-121.