晉金蘭，韋建瑞，尹海燕，梁艷雯，郭鍵，呂榮貴，劉喜鴻

基礎(chǔ)與實驗研究

鹽酸小檗堿對大鼠心肌梗死模型心室重塑的作用研究

晉金蘭，韋建瑞，尹海燕，梁艷雯，郭鍵，呂榮貴，劉喜鴻

目的：研究鹽酸小檗堿對大鼠心肌梗死（心梗）模型心室重塑的作用并探討其機制。

方法：采用冠狀動脈結(jié)扎法復(fù)制大鼠心梗模型，建好模型隨機分為兩組，心梗對照組和鹽酸小檗堿組，同時設(shè)立假手術(shù)組。鹽酸小檗堿組大鼠每日灌胃給予鹽酸小檗堿20 mg/kg，假手術(shù)組和心梗對照組每日給予同等劑量生理鹽水。8 W后超聲心動圖檢測大鼠心功能和心臟結(jié)構(gòu)，馬松（Masson）染色法檢測心肌間質(zhì)膠原容積分數(shù)，Tunel法檢測心肌細胞凋亡情況，并檢測心肌細胞核因子-κB活化情況。

結(jié)果：超聲心動圖檢測結(jié)果顯示，心梗對照組與假手術(shù)組相比，左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）擴大[（7.28 ± 0.29）mm比（6.86 ± 0.36）mm，P ＜ 0.05]、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVDs）擴大[（5.88 ± 0.33）mm比（4.61 ± 0.31）mm，P＜ 0.01]、左心室后壁收縮末期厚度（LVPWTs）增厚[（1.81 ± 0.85）mm比（1.67 ± 0.16）mm，P ＜ 0.05]，左心室射血分數(shù)（LVEF）下降[（45.77 ± 3.17）% 比（67.28 ± 4.15）%，P ＜ 0.01]；鹽酸小檗堿組與心梗對照組相比：LVDs[（4.68 ± 1.17）mm]縮小，LVPWTs[（1.65 ± 0.14）mm]下降，LVEF[（64.64 ± 5.82）%]增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜ 0.01）；而LVDd[（6.89 ± 0.99）mm]縮小，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Masson染色結(jié)果顯示，心梗對照組與假手術(shù)組相比，膠原容積分數(shù)增加[（11.39 ± 0.45）% 比（2.65 ± 0.45）%，P ＜ 0.01]，鹽酸小檗堿組 [（7.00 ± 0.87）% ]較心梗對照組減少（P ＜ 0.01）。Tunel實驗結(jié)果顯示，心梗對照組與假手術(shù)組相比，心肌細胞凋亡指數(shù)增加（21.31 ± 2.34比0.99 ± 0.38，P ＜ 0.01），鹽酸小檗堿組（14.15 ± 1.62）較心梗對照組減少（P ＜ 0.01）。核因子-κB活化情況檢測結(jié)果示，術(shù)后8 W時，心梗對照組與假手術(shù)組相比，細胞核內(nèi)的p65含量增加[（0.14±0.02）ng/ml比（0.06±0.01）ng/ml]，鹽酸小檗堿組[（0.10±0.02）ng/ml]較心梗對照組減少。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。

結(jié)論：鹽酸小檗堿可改善大鼠心梗模型心室重塑和心功能，其機制考慮與其部分抑制心肌細胞核因子-κB活化、降低非心梗區(qū)心肌間質(zhì)膠原沉積、抗心肌細胞凋亡有關(guān)。

鹽酸小檗堿；心肌梗死模型；心室重塑；核因子-κB

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:795.)

急性心肌梗死（心梗）后發(fā)生的心室重塑是導(dǎo)致此類患者發(fā)展為心力衰竭（心衰）的重要原因。如何有效防止心室重塑的發(fā)生發(fā)展成為近年來心衰防治的研究熱點。目前針對急性心梗的發(fā)生機制及心室重塑的病理生理而采用的血運再通、拮抗神經(jīng)內(nèi)分泌異常激活等治療方法雖取得了較好療效，但心衰患者5年死亡率仍然接近50%[1]。這提示關(guān)于如何預(yù)防及逆轉(zhuǎn)心室重塑的發(fā)生發(fā)展仍存在一些未知領(lǐng)域有待人們深入探索研究。

鹽酸小檗堿（Sigma-Aldrich）近年來被發(fā)現(xiàn)具有抗心衰的作用，但具體機制尚不明確。炎癥反應(yīng)在心梗后心室重塑發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)在因缺血或擴張型心肌病導(dǎo)致心衰的患者，其移植換下來的心臟和大鼠心衰模型的心肌細胞上，核因子-κB都是顯著激活的[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿對許多組織器官的核因子-κB活性具有抑制作用[3-6]，但其對大鼠心梗模型心肌細胞核因子-κB的作用如何罕有文獻報道。本實驗旨在研究鹽酸小檗堿對大鼠心梗模型心室重塑的作用并探討其機制，以期為心衰的防治找到新的輔助治療方法。

1 材料與方法

實驗時間：2013-06至2014-05。實驗動物：成年雄性SD大鼠，體重（250±10）g，50只，廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXK粵 2008-0002）。水合氯醛（上海試劑二廠），小動物呼吸機Model 683（美國自然基因有限公司），BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），單腔中心靜脈導(dǎo)管（7 Fr單腔20 cm導(dǎo)管，Biosensors International Pteltd, 新加坡），鹽酸小檗堿（Sigma-Aldrich，美國），Power Vision 8000超聲診斷儀（TOSHBA，日本），馬松（Masson）三色染色試劑盒（南京森貝伽生物有限公司），Tunel細胞凋亡試劑盒（武漢博士德公司）。TransAM NF-κB p65 Transcription Factor Assay Kits（Active motif, 美國）。

大鼠心梗模型的復(fù)制及實驗分組：10%水合氯醛（3.8 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，頸部正中皮膚切一長約1.5 cm的小口，逐層分離肌肉、筋膜，暴露氣管，導(dǎo)引鋼絲刺入3、4氣管軟骨環(huán)間隙，朝口腔方向緩慢送出至口腔外，將深靜脈導(dǎo)管沿導(dǎo)絲送入氣管，退出導(dǎo)絲，導(dǎo)管開口連接小動物呼吸機輔助通氣（潮氣量：3 ml/100 g體重；呼吸頻率：60次/ min；吸呼比：1:1）。選擇胸骨左緣第3～4肋間開胸，充分暴露心臟，在左心耳與肺動脈圓錐連線中點下方2 mm處結(jié)扎冠狀動脈，當(dāng)結(jié)扎區(qū)域心肌組織變白、心臟運動減弱及心電圖兩個以上肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段上抬≥0.2 mV時判斷造模成功。逐層縫合肌肉和皮膚。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)。連續(xù)3 d腹腔注射青霉素10萬U以預(yù)防傷口感染。將術(shù)后24 h存活大鼠分為假手術(shù)組10只（僅在血管下穿線而不結(jié)扎血管），40只制作心梗模型存活大鼠30只，隨機分為2組，心梗對照組和鹽酸小檗堿組，每組15只。鹽酸小檗堿組大鼠每日給予鹽酸小檗堿20 mg/kg灌胃，假手術(shù)組和心梗對照組大鼠給予同等劑量生理鹽水灌胃。給藥時間為8 W。

大鼠模型超聲心動圖檢測：將用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉的大鼠仰置于自制木板上，用超聲診斷儀（頻率12 MHz）進行心臟超聲檢查。左心室長軸切面測量大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDd），左心室收縮末期內(nèi)徑（LVDs），左心室短軸M型切面測量左心室后壁收縮末期厚度（LVPWTs），讀取左心室射血分數(shù)（LVEF），連續(xù)測量3個心動周期數(shù)值，取其均值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

Masson染色法檢測心肌間質(zhì)膠原沉積情況：術(shù)后8 W時處死大鼠，摘除心臟，取心臟非心梗區(qū)心肌組織多聚甲醛固定24 h梯度酒精脫水石蠟包埋，組織切片，蘇木素伊紅染色5 min，麗春紅染色7 min，苯胺藍復(fù)染10 min，1 %冰醋酸處理2 min；95 %、100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。用IPP 6.0圖像采集分析系統(tǒng)采圖分析計算每個視野中膠原組織所占的百分比，最后各組取平均數(shù)代表膠原容積百分比并計算膠原容積分數(shù)。

脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Tunel法）測定心肌細胞凋亡情況：心肌組織多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水石蠟包埋，組織切片，37 ℃恒溫箱烤片過夜、脫蠟。切片分別滴加蛋白酶K溶液37℃30 min，末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶和生物素化抗地高辛抗體各1 μl ，標(biāo)記緩沖液18 μl，混勻后甩干切片上液體后加標(biāo)記液20 μl /片，置濕盒37℃標(biāo)記 2 h終止；室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，50 μl /片1:100 稀釋生物素化抗地高辛抗體，置濕盒37℃反應(yīng)30 min；50 μl /片1:100 稀釋鏈霉素—生物素復(fù)合物，37℃ 30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色，蘇木素伊紅輕度復(fù)染，中性樹脂封片，鏡下觀察：凋亡陽性細胞分布情況，每張片雙人雙盲拍攝3個陽性視野，以陽性細胞數(shù)所占觀察心肌細胞的比例作為凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/（凋亡細胞數(shù)目+正常細胞數(shù)目）× 100 % 。

大鼠心梗模型心肌細胞核因子-κB活化情況：核因子-κB靜息狀態(tài)下以二聚體形式與其天然的阻遏蛋白IκB結(jié)合，以無活性狀態(tài)存在于細胞漿。當(dāng)細胞受到外源性刺激時，引起IκB降解，核因子-κB得以活化進入細胞核內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。

實驗中我們采用TransAM NF-κB p65 Transcription Factor Assay Kits檢測大鼠模型心肌細胞核因子-κB活化情況，通過試劑盒檢測轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)的p65含量來反應(yīng)核因子-κB的活化程度。根據(jù)不同濃度的標(biāo)準品及其對應(yīng)的吸光度值繪制p65蛋白吸光度—濃度標(biāo)準曲線，樣品p65蛋白濃度為標(biāo)準曲線上吸光度值相對應(yīng)的濃度。具體實驗步驟按照試劑盒說明書進行操作[7]。

2 結(jié)果

大鼠心梗模型造模結(jié)果：術(shù)后8 W時假手術(shù)組存活大鼠8只，心梗對照組存活大鼠12只，鹽酸小檗堿組存活大鼠15只。

大鼠心梗模型超聲心動圖檢測結(jié)果（表1）：心梗對照組與假手術(shù)組相比， LVDd擴大（P ＜ 0.01）、LVDs擴大（P ＜ 0.01）、LVPWTs增厚（P ＜ 0.05），LVEF下降（P ＜ 0.01）；鹽酸小檗堿組與心梗對照組相比LVDs縮小、LVPWTs下降，LVEF增加（P均＜0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。鹽酸小檗堿組與心梗對照組相比LVDd差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 術(shù)后8 W時大鼠模型心功能及心臟結(jié)構(gòu)超聲心動圖檢測結(jié)果

表1 術(shù)后8 W時大鼠模型心功能及心臟結(jié)構(gòu)超聲心動圖檢測結(jié)果

注：與假手術(shù)組相比*P＜ 0.05**P＜ 0.01；與心梗對照組相比△P＜ 0.01

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心肌組織膠原容積分數(shù)檢測結(jié)果（圖1）：心梗對照組與假手術(shù)組相比，膠原容積分數(shù)增加，而鹽酸小檗堿組較心梗對照組減少（P ＜ 0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

心肌細胞凋亡檢測結(jié)果（圖2）：心梗對照組與假手術(shù)組相比，心肌細胞凋亡指數(shù)增加，而鹽酸小檗堿組較心梗對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。

心肌細胞核因子-κB活化情況：術(shù)后8 W時，心梗對照組與假手術(shù)組相比，細胞核內(nèi)的p65含量增加[（0.14±0.02）ng/ml比（0.06±0.01）ng/ml]，而鹽酸小檗堿組[（0.10±0.02）ng/ml]較心梗對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。

圖1 術(shù)后8 W時三組大鼠心臟非心梗區(qū)光學(xué)顯微鏡圖（×400）

圖2 術(shù)后8 W時三組大鼠心梗模型心臟非心梗區(qū)凋亡心肌細胞熒光顯微鏡圖（×400）

3 討論

如何預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心梗后心室重塑成為心衰防治的研究熱點[8,9]。近年研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在心梗后心室重塑病理生理過程中起重要作用[10,11]。心梗后，熱休克蛋白、透明質(zhì)酸等成分以“危險”信號的身份參與Toll樣受體結(jié)合，最終激活核因子-κB，引發(fā)無菌性炎癥和天然免疫應(yīng)答[12]。目前研究人員認為對于以炎癥為靶點的心梗后心室重塑干預(yù)策略至關(guān)重要。

近年藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿具有顯著抗心衰作用，但具體機制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿對許多組織器官的核因子-κB活性具有抑制作用[3-6]，但其是否可通過調(diào)控大鼠心梗模型心肌細胞核因子-κB的活性而起到抗心衰作用目前少見文獻報道。

實驗中我們給大鼠心梗模型鹽酸小檗堿8 W，然后檢測其對大鼠心功能和心臟結(jié)構(gòu)的影響，檢測了大鼠模型心臟非心梗區(qū)心肌膠原容積分數(shù)和心肌細胞的凋亡情況以及心肌細胞核因子-κB活化情況，以探討其對心梗后心室重塑產(chǎn)生作用的機制。實驗結(jié)果顯示鹽酸小檗堿對大鼠心梗模型心室重塑具有保護作用，它可改善大鼠心梗模型的心肌間質(zhì)纖維化，抑制心肌細胞凋亡，部分抑制核因子-κB的活化。

核因子-κB是廣泛存在于細胞內(nèi)的一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與多個基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Frantz等[13]在實驗研究中發(fā)現(xiàn)核因子-κB亞單位p50的缺乏可改善心梗后心衰小鼠模型的心室膨脹，他們認為其機制可能與心臟膠原含量降低和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達降低有關(guān)。Davies等[14]也得出類似的結(jié)論。另有研究顯示核因子-κB受抑制時，可能通過減輕前炎癥反應(yīng)以及調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)以阻止心梗后心室重塑的進展[13,15]。當(dāng)心肌纖維細胞的核因子-κB被激活后可誘導(dǎo)血管緊張素原或血管緊張素Ⅱ受體1型的表達，促進血管緊張素Ⅱ在心室重塑中的作用，加劇心肌肥厚及心功能惡化[16]。近期亦有學(xué)者提出核因子-κB與Notch信號通路的相互作用可能也參與了心梗后心室重塑的發(fā)生發(fā)展，但它們之間究竟存在何種相互作用及如何利用它們之間的關(guān)系來達到預(yù)防和（或） 逆轉(zhuǎn)心梗后心室重塑成為新的研究方向。

綜上所述，本實驗結(jié)果提示鹽酸小檗堿可改善大鼠心梗模型心室重塑，其機制考慮與其部分抑制心肌細胞核因子-κB活化、降低心肌間質(zhì)膠原沉積及抗心肌細胞凋亡有關(guān)，具體分子作用機制有待進一步研究。

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Effect of Bererine on Ventricular Remodeling in Experimental Rats With Myocardial Infarction

JIN Jin-lan, WEI Jian-rui, YIN Hai-yan, LIANG Yan-wen, GUO Jian, LV Rong-gui, LIU Xi-hong.
Central Intensive Care Unit, Guangzhou Red Cross Hospital, Fourth Affiliated Hospital of Medical College, Jinan University, Guangzhou (510220), Guangdong, China

Objective: To study the effect of berberine (BR) on ventricular remodeling in experimental rats with myocardial infarction (MI) and its mechanisms.Methods: The MI model of experimental rats was established by ligation of the left anterior descending coronary artery and the MI animals were randomly divided into 3 groups: MI+BR group, in which the rats received BR 20 mg/kg.d, Sham group and MI group, the rats in those 2 groups received the same volume of normal saline. All animals were treated for 8 weeks. The cardiac function and structure were assessed by echocardiography, cardiac interstitial collagen deposition was evaluated by Masson stain, the myocardial cell apoptosis was detected by Tunel method, and the activation of nuclear factor (NF-κB) was also examined.Results: For echocardiography, MI group had enlarged left ventricular end diastolic diameter (7.28 ± 0.29) mm than Sham group (6.86 ± 0.36) mm, P＜0.05, but it decreased in MI+BR group (6.89 ± 0.99) mm, P＞0.05. MI group had increased left ventricular end systolic diameter (5.88 ± 0.33) mm than Sham group (4.61 ± 0.31) mm, but it decreased in MI+BR group (4.68 ± 1.17) mm, all P＜ 0.01. MI group showed increased left ventricular posterior wall compensatory hypertrophy (1.81 ± 0.85) mm than Sham group (1.67 ± 0.16 mm), P＜0.05, while in MI+BR group, it was deereased to (1.65 ± 0.14) mm. MI group presented decreased LVEF (45.77 ± 3.17) % than Sham group (67.28 ± 4.15) %, but it increased in MI+BR group (64.64 ± 5.82) %, all P＜0.01. For Masson stain, cardiac interstitial collagen deposition in MI group (11.39 ± 0.45) % was higher than Sham group (2.65 ± 0.45) %, but less in MI+BR group (7.00 ± 0.87) %, all P＜0.01. For Tunel examination, the myocardial cell apoptosis index was increased in MI group (21.31 ± 2.34) than Sham group (0.99 ± 0.38), but decreased in MI+BR group (14.15 ± 1.62), all P＜0.01. For NF-κB activation study, the nuclear protein p65 content was higher in MI group (0.14 ± 0.02) ng/ml than Sham group (0.06 ± 0.01) ng/ml, but lower in MI+BR group (0.10 ± 0.02) ng/ml, all P＜0.01.Conclusion: Application of BR may improve the ventricular remodeling and cardiac function in experimental MI rats, it might be because of BR partially inhibit NF-κB activation, reduce collagen deposition and help anti-apoptosis in myocardial cells.

Berberine; Myocardial infarction model; Ventricular remodeling; Nuclear factor-κB

2015-02-03）

（編輯：漆利萍）

廣東省建設(shè)中醫(yī)藥強省科研課題（20141217）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項目（B2012034）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（20151A011015）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（20141A011019）

510220 廣東省廣州市，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院 廣州市紅十字會醫(yī)院 中心ICU（晉金蘭、尹海燕、梁艷雯），心內(nèi)科（韋建瑞、呂榮貴），超聲科（劉喜鴻）；中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)實驗室（郭鍵）

晉金蘭 副主任醫(yī)師 博士 研究方向為心力衰竭的防治 Email: jinjinlan@163.com 通訊作者：韋建瑞 Email：jianruiwei@163.com

R541

A

1000-3614（2015）08-0795-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.08.019