張 玲,李 麗,王金莉
(遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州 121001)
木香為菊科云木香屬植物木香的干燥根,具有調(diào)中宣滯,行氣止痛,解痙、松弛平滑肌、抗炎等作用,獸醫(yī)臨床常用其改善反芻動(dòng)物瘤胃環(huán)境,治療瘤胃積食(魏華,2012)。木香主要的活性成分為木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯,均屬于倍半萜內(nèi)酯,是木香質(zhì)量控制的主要指標(biāo) (國(guó)家藥典委員會(huì),2010)。響應(yīng)面分析法(RSM)是利用中心組合試驗(yàn)擬合出完整的二次多項(xiàng)式模型以優(yōu)化工藝條件的方法(Li,2005)。通過(guò)求出的最佳參數(shù),使得試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表達(dá)更加優(yōu)良,最優(yōu)組合條件也更直觀、更精確(范東斌等,2014;王萬(wàn)中,2004)。 本研究采用微波輔助提取法提取木香中的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯,動(dòng)用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。
1.1.1 儀器與設(shè)備 LC-10A高效液相色譜儀(日本島津株式會(huì)社)、EZChrom色譜工作站、UV-2550紫外分光光度計(jì)(日本島津株式會(huì)社)、水浴鍋(天津中環(huán)科技電子公司)、BP121S電子分析天平(德國(guó)賽多利斯)、DFY-200型粉碎機(jī)(溫嶺大德中藥粉碎廠)、微波提取裝置HWC-10B(廣州興興微波設(shè)備有限公司)。
1.1.2 試藥 木香,購(gòu)自甘肅隴原中藥材開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司;木香烴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品,來(lái)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所(批號(hào):111524-201203);去氫木香內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品,來(lái)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所 (批號(hào):111525-201205);乙醇為醫(yī)用級(jí);其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純;水為雙蒸水。
1.2.1 木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量測(cè)定
1.2.1.1 對(duì)照品的制備 分別取木香烴內(nèi)酯對(duì)照品和去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量,精密稱取,加甲醇溶解,分別配制成每毫升中含1 mg木香烴內(nèi)酯和1 mg去氫木香內(nèi)酯的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別從其中精密吸取1 mL至量瓶中,加甲醇定容至10 mL,即得含有木香烴內(nèi)酯(100 μg/mL)和去氫木香內(nèi)酯(100 μg/mL)的混合對(duì)照品溶液。
1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用HPLC分析1.2.1.1中的混合對(duì)照品溶液,采用ZORBAX SBC18 柱(150 mm×4.6 mm,5 μ),流動(dòng)相為甲醇-水(65∶35),檢測(cè)波長(zhǎng)為 225 nm,流速為 1 mL/min,進(jìn)樣量為 3、5、10、15、20、25、30、35 μL,測(cè)得峰面積積分值。以峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo),對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(C)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯回歸方程和線性范圍:
Y=0.263X-6.435(r=0.9995);
進(jìn)樣量為72.42~914.07 ng時(shí)與峰面積有良好的線性關(guān)系。
1.2.1.3 木香有效成分的提取及提取率計(jì)算 參考錢(qián)偉(2013)的提取方法,取木香飲片,適當(dāng)粉碎,精密稱取3.0 g木香,置于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,靜置12 h,選取適當(dāng)微波功率和提取時(shí)間,損失的重量用甲醇補(bǔ)足,放冷,濾過(guò)。按1.2.1.2項(xiàng)的測(cè)定方法,結(jié)合回歸方程計(jì)算得到木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的質(zhì)量,再計(jì)算提取率:
提取率=提取液中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的質(zhì)量/投藥量×100。
1.2.2 單因素試驗(yàn) 本試驗(yàn)分別選取微波功率、提取時(shí)間和料液比作為考察的單因素,按照1.2.1.3方法提取,并計(jì)算提取率。
1.2.2.1 微波功率對(duì)提取率的影響 在提取時(shí)間7 min、料液比 1∶15(g/mL)的條件下,研究微波功率(200、300、400、500、600 W)對(duì)提取率的影響。
1.2.2.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 在微波功率400 W、料液比 1∶15(g/mL)的條件下,研究提取時(shí)間(3、5、7、9、12 min)對(duì)提取率的影響。
1.2.2.3 料液比對(duì)提取率的影響 在微波功率400 W、提取時(shí)間7 min的條件下,研究料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)]對(duì)提取率的影響。
1.2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)水平基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,以提取率(Y)為響應(yīng)值,選取微波功率(W)、提取時(shí)間(min)和料液比(g/mL)三個(gè)影響因素,利用Design Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)(張百霞,2013)。因素及水平見(jiàn)表1。
表1 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 微波功率對(duì)提取率的影響 由圖1可見(jiàn),隨微波功率的增加,木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的提取率逐漸增大,當(dāng)微波功率達(dá)到400 W時(shí),二者的提取率最高,之后逐漸下降,故考慮選用400 W微波功率為宜。
圖1 微波功率對(duì)提取率的影響
2.1.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 由圖2可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的提取率也隨之增大,在9 min時(shí)達(dá)到最大。隨著微波時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),提取率則有所下降??紤]選擇微波時(shí)間為9 min。
圖2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響
2.1.3 料液比對(duì)提取率的影響 由圖3可知,隨著料液比的升高,兩種成分的提取率逐漸增加,但當(dāng)料液比超過(guò)1∶15(g/mL)以后,提取率又迅速下降,故選擇 1∶15(g/mL)的料液比為宜。
圖3 料液比對(duì)提取率的影響
2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn) 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)的取值見(jiàn)表2,共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(3個(gè)中心點(diǎn))用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差(何力等,2010)。每次木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯提取率見(jiàn)表2。
表2 響應(yīng)曲面優(yōu)化工藝方案及結(jié)果
2.2.1 回歸方程 利用軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到模型的二次多元回歸方程。
提取率 (Y)/%=2.12+0.015A+3.750×10-3B+0.035C-9.804×10-4AB-0.025AC-0.017BC-0.14A2-0.10B2-0.060C2。
2.2.2 回歸模型方差分析 對(duì)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。模型的P<0.01;模型的校正確定系數(shù)R2>0.95;料液比的一次項(xiàng)和三個(gè)因素的二次項(xiàng)對(duì)木香提取物的提取率有顯著影響(P<0.05);微波功率、提取時(shí)間的一次項(xiàng)和三個(gè)因素的交互項(xiàng)對(duì)兩種物質(zhì)提取率的影響不顯著。
回歸模型的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖4。圖4a表明,當(dāng)提取時(shí)間比較短時(shí),微波功率對(duì)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯提取率的影響比較顯著,表現(xiàn)為曲線較陡;隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),微波功率增大,提取率先增高后降低。圖4b表明,兩種物質(zhì)的提取率隨著微波功率和料液比的增加先快速增加,而后略有減小,等高線圖表明,兩因素的交互作用較強(qiáng),影響顯著。圖4c表明,在微波時(shí)間為9~11 min、料液比為 1∶18~1∶14(g/mL)時(shí),木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯提取率可達(dá)到最大值。
表3 響應(yīng)曲面回歸模型方差分析
圖4 兩因素交互作用對(duì)木香提取物提取率影響的響應(yīng)曲面圖
2.2.3 最優(yōu)工藝條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 利用Design-Expert軟件分析提取木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的最優(yōu)條件為:微波功率402.76 W、提取時(shí)間 9.49 min、料液比 1∶16.41(g/mL),此時(shí)模型預(yù)測(cè)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的提取率為2.12%??紤]實(shí)際操作,將實(shí)驗(yàn)條件修改為微波功率403 W、微波時(shí)間 9.5 min、料液比為 1∶16.5(g/mL),并在此修正條件下進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯提取率的平均值為2.08%。
在單因素試驗(yàn)中,木提取物的提取率隨著微波功率的增加先增大后減少,分析可能是過(guò)高微波功率會(huì)使分子運(yùn)動(dòng)加劇,導(dǎo)致木香中所有成分的溶出均增多(董發(fā)明和白喜婷,2008),從而使木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯所占比率下降;而提取率隨微波時(shí)間發(fā)生變化的原因可能上述相同。料液比對(duì)提取率的影響結(jié)果表明,提取率先是隨著料液比增加而提高,在超過(guò)1∶15后又有所下降,分析可能是甲醇體積的適當(dāng)增加可以使木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯更充分溶出,但當(dāng)甲醇過(guò)多時(shí),一些醇溶性雜質(zhì)的溶出量也隨之增多 (朱珠和冷進(jìn)松,2010),因此提取率又下降。
本試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)曲面法考察微波功率、提取時(shí)間和料液比對(duì)木香提取物提取率的影響。二次多元方程模型的回歸差異極顯著(P<0.01);失擬項(xiàng)P>0.05,不顯著;模型的校正確定系數(shù)R2大于0.95,說(shuō)明響應(yīng)值的98.62%來(lái)源于所選變量,以上結(jié)果說(shuō)明回歸方程擬合程度良好,可以很好地描述考察因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。
在修正條件下分三次提取木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯,實(shí)際提取率為2.08%,與預(yù)測(cè)值僅差0.04%;三次提取率的RSD為1.272%,表明利用響應(yīng)曲面法得到的優(yōu)化結(jié)果具有實(shí)用價(jià)值。
微波法提取木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的最佳工藝條件為:微波功率403 W、提取時(shí)間9.5 min、料液比 1∶16.5(g/mL)。在最佳工藝條件下的提取驗(yàn)證試驗(yàn)表明,木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的提取率為2.08%。
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