加味烏梅丸抑制非肥胖糖尿?。匕Y聯(lián)合免疫缺陷小鼠胰腺癌移植瘤的蛋白組學(xué)研究

趙偉鵬，姜 欣，黃金昶

（1．北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2．中日友好醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科，北京 100029）

胰腺癌是一種消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)。本課題組運(yùn)用加味烏梅丸治療胰腺癌近20年，臨床療效較為理想［1］。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，加味烏梅丸可以抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［2］。但是，加味烏梅丸抗腫瘤作用的分子機(jī)制還不完全清楚，其作用靶點(diǎn)的蛋白組學(xué)研究還未進(jìn)行。本研究在之前研究基礎(chǔ)上直接從蛋白質(zhì)整體水平入手，初步研究加味烏梅丸對(duì)非肥胖糖尿?。╪on－obese diabetes，NOD）／重癥聯(lián) 合 免 疫 缺 陷 （severe combined immune deficiency，SCID）小鼠胰腺癌移植瘤組織蛋白表達(dá)譜的影響，旨在從蛋白組學(xué)水平研究該藥抗胰腺癌的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

①細(xì)胞株SW1990：購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)，復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。②SPF級(jí)NOD／SCID小鼠，雄性，3～4周齡，體質(zhì)量（20±2）g，共20只，購(gòu)自維通利華。購(gòu)回后在中日友好醫(yī)院臨床研究所SPF級(jí)動(dòng)物室普食飼養(yǎng)。③加味烏梅丸（烏梅50g，白芍、生黃芪、壁虎各30g，當(dāng)歸20g，桂枝、黃柏、黨參、干姜、制附子、炒枳殼、木香各10g，川椒6g，細(xì)辛、黃連各3g，等）：中藥飲片購(gòu)自北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心，由中日友好醫(yī)院藥學(xué)部制備，常規(guī)水煎，水浴濃縮至生藥含量2．0g／mL，4℃ 保存?zhèn)溆?。④Q Exactive質(zhì)譜 儀：Thermo Scientific 公 司。iTRAQTMReagents：AB Sciex公司，批號(hào) A4115。⑤高效液相系統(tǒng)：戴安NCS3500系統(tǒng)，德國(guó)賽默飛世爾公司生產(chǎn)。

2 方法

2．1 NOD／SCID小鼠移植瘤模型復(fù)制 人胰腺癌SW1990細(xì)胞株在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5×107／mL細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，取0．1mL接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，在SPF環(huán)境飼養(yǎng)下觀察。成瘤率＝瘤體積直徑大于5mm的小鼠數(shù)／該實(shí)驗(yàn)組的小鼠數(shù)×100%。

2．2 分組給藥 在小鼠移植瘤皮下可觸及，腫瘤直徑增大至0．5cm時(shí)，將荷瘤小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（n＝10）和加味烏梅丸組（n＝10）。分組后加味烏梅丸組每日灌胃給予生藥40g／kg。對(duì)照組每日給予無菌注射用水0．4mL。每組灌胃容積均為0．4 mL。

2．3 腫瘤蛋白提取 給藥20d后處死小鼠，剝離瘤體，將樣品分別在加入液氮的研缽中研磨至極細(xì)粉末狀，將樣品轉(zhuǎn)移至新的1．5mL離心管，按照10 mL／g加入 RIPA提取液（配方：150mmol／L NaCl，1%NP40，0．5%DOC，0．1%SDS，50mmol／L Tris，使用前加入蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min，每5min輕輕振蕩混勻。離心（4℃，14 000r／min）15min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管。上清液即提取的全蛋白。使用BCA法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

2．4 iTRAQ標(biāo)記 根據(jù)BCA檢測(cè)結(jié)果，每個(gè)樣品取蛋白100μg于一個(gè)1．5mL離心管中，樣品加入8mol／L尿素（含0．1%SDS）和超純水（含0．1%SDS），加入9μL 500mmol／L TEAB。按 AB Sciex公司iTRAQTM試劑盒（目錄號(hào)4390812）說明書進(jìn)行樣品處理和標(biāo)記。混合標(biāo)記后的樣品用于強(qiáng)陽(yáng)離子柱分級(jí)。

2．5 強(qiáng)陽(yáng)離子柱樣品分級(jí)

2．5．1 強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜緩沖液 ①A：5mmol／L KH2PO4（pH 2．55），20% 乙 腈，H3PO4。②B：5 mmol／L KH2PO4（pH 2．75），20%乙腈，600mmol／L KCl，H3PO4。

2．5．2 色譜柱平衡 參照高效液相色譜儀（型號(hào)Agilent 1260）使用規(guī)程進(jìn)行操作。強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱（5μm，200孔，孔徑2．1mm，長(zhǎng)100mm，美國(guó)PolyLC）使用前用100%A平衡25min。運(yùn)行多肽測(cè)試品確認(rèn)儀器和色譜柱狀態(tài)良好。標(biāo)記樣品取300μL用A液稀釋7倍，用磷酸調(diào)pH值至2．5，離心，取上清上樣。收集上樣流出液體。

2．5．3 梯度洗脫 洗脫梯度設(shè)置如下：0%～5%B，3min；5% ～20%B，18min；20% ～30%B，6min；30%～100%B，6min。檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，高效液相色譜圖見圖1。用1．5mL離心管每分鐘收集一個(gè)組分。

根據(jù)色譜圖合并連續(xù)的多肽含量較少的樣品，共形成20個(gè)組分。使用C18離心柱對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行脫鹽處理。真空抽干。

2．6 質(zhì)譜檢測(cè) 將樣品用上樣緩沖液充分溶解后上樣到液質(zhì)聯(lián)用儀，使用C18柱（2μm，100孔，孔徑75 μm，長(zhǎng)25cm，美國(guó)Dionex）對(duì)多肽進(jìn)行分離。液相色譜A相為99．9%水、0．1%甲酸。B相為99．9%乙腈、0．1%甲酸。液相色譜洗脫條件見表1。

表1 液相色譜洗脫梯度參數(shù)

質(zhì)譜檢測(cè)的參數(shù)設(shè)置如下：質(zhì)譜儀為Q－Exac－tive，離子源電壓2．3kV，離子傳輸管溫度270℃，采集模式為數(shù)據(jù)依賴模式，質(zhì)譜全掃描范圍質(zhì)荷比為350～1 800，分辨率為70 000。全掃描中選擇離子強(qiáng)度前20位的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定，二級(jí)掃描分辨率為17 500。母離子使用高能碰撞誘導(dǎo)解離（higher energy collision dissociation，HCD）法 碎裂，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜序列測(cè)定，同時(shí)用報(bào)告離子的比例定量。

2．7 數(shù)據(jù)分析 質(zhì)譜檢測(cè)原始文件使用Proteome Discoverer 1．4軟件的Sequest搜索引擎與NCBI網(wǎng)站（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov）的 Human Refseq蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（71 465個(gè)蛋白，2014年3月3日更新）進(jìn)行搜索。參數(shù)設(shè)置如下：母離子允許誤差范圍20ppm，子離子允許誤差范圍0．02Da，可變修飾為Oxidation（Met），固定修飾為carbamidomethyl（Cys）和iTRAQ8plex（Any N－Terminus，Lys），胰酶酶切，允許一個(gè)漏切位點(diǎn)。

3 結(jié)果

從質(zhì)譜結(jié)果看，在1%錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）的條件下，共鑒定和定量了3 741種蛋白。鑒定多肽種類數(shù)為23 450。差異分析結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，兩組樣品中共有50個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)相差1．5倍以上。進(jìn)一步篩選標(biāo)準(zhǔn)為鑒定unique peptides兩條以上且定量次數(shù)≥3。共得到鑒定明確、差異顯著的蛋白12個(gè)，其中10個(gè)下調(diào)（見表2），2個(gè)上調(diào)（見表3）。選取其中典型蛋白（8號(hào)蛋白）多肽1、2、3進(jìn)行鑒定，分別見圖2、圖3、圖4。

表2 表達(dá)下調(diào)最顯著的10個(gè)蛋白

表3 表達(dá)上調(diào)最顯著的2個(gè)蛋白

4 討論

加味烏梅丸為溫肝陽(yáng)、祛寒邪、理氣活血方劑，前期臨床觀察［1］發(fā)現(xiàn)，服用加味烏梅丸能很快改善患者的臨床癥狀，尤其對(duì)胰腺癌患者的疼痛、食欲下降改善較明顯，使不能行放射治療、化學(xué)治療的胰腺癌患者臨床獲益71．43%，生存期得到延長(zhǎng)。而前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［2］也證實(shí)加味烏梅丸可以抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)利用蛋白組學(xué)從整體角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)。共得到12差異蛋白點(diǎn)，其中包括：細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、代謝相關(guān)蛋白、硒結(jié)合蛋白、酶類物質(zhì)等。其中一些差異蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，且被較多地研究。

其中8號(hào)和9號(hào)點(diǎn)均為肌球蛋白輕鏈。肌球蛋白作為一種超家族蛋白質(zhì)，是細(xì)胞骨架的重要組成部分，通過各種調(diào)節(jié)因子對(duì)其輕鏈磷酸化和去磷酸化進(jìn)行調(diào)節(jié)，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用。肌球蛋白輕鏈的磷酸化是腫瘤細(xì)胞增殖的必要條件，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light－chain kinase，MLCK）促使乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，而其抑制劑處理的肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌及乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制、數(shù)目增長(zhǎng)緩慢，增殖受影響［3］。張孝林等［4］實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過下調(diào)肝組織MLCK的表達(dá)水平誘導(dǎo)凋亡，抑制大鼠肝腫瘤細(xì)胞的增生。9號(hào)蛋白是肌球蛋白輕鏈骨骼肌型，8號(hào)蛋白為調(diào)節(jié)性肌球蛋白輕鏈2（myosin light chain 2，MLC2），磷酸化 MLC2能調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。沈傳陸［5］用酵母雙雜交方法發(fā)現(xiàn)MLC2是癌蛋白TRE17的結(jié)合蛋白，而TRE17癌基因在多種惡性腫瘤如平衡肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、前列腺癌、乳癌、腎癌和膀胱癌中異常表達(dá)。毫無疑問，MLC為MLCK的作用底物，用藥組極有可能通過下調(diào)MLC及MLC2，進(jìn)而抑制肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈的磷酸化，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

7號(hào)和10號(hào)點(diǎn)均為脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acidbinding protein，F(xiàn)ABP），7 號(hào) 點(diǎn) 為 脂 肪 細(xì) 胞 型FABP（fatty acid binding protein 4，adipocyte，AFABP），10號(hào)點(diǎn)為心臟型 FABP（fatty acid binding protein，heart，H－FABP），F(xiàn)ABP是一組運(yùn)輸長(zhǎng)鏈脂肪酸的低分子量胞漿蛋白超家族，其各成員均具有組織特異性。研究報(bào)道FABP在基因水平和組織中表達(dá)的變化，與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)。推測(cè)FABP在細(xì)胞的有絲分裂中起重要作用，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖。現(xiàn)在對(duì)于FABP與惡性腫瘤關(guān)系的研究主要集中在乳腺癌、泌尿系惡性腫瘤及肝癌上。李華等［6］認(rèn)為FABP是乳腺組織中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存和能量代謝的關(guān)鍵因子。在腫瘤細(xì)胞，F(xiàn)ABP不但可轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量及原材料，還可結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)各種配體，參與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。其通過研究發(fā)現(xiàn)表皮型FABP（fatty acid binding protein 5，epidermal，EFABP）、H－FABP和肝臟型FABP（fatty acid binding protein 1，liver，L－FABP）在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌較良性纖維腺瘤表達(dá)明顯上調(diào)，推測(cè)它們與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)L－FABP在肝細(xì)胞癌癌組織中的表達(dá)顯著高于慢性乙型肝炎肝組織，提示FABP可能在肝細(xì)胞癌變中起著一定作用［7］。而在膀胱癌的研究中卻發(fā)現(xiàn)在侵襲性膀胱癌中，A－FABP的表達(dá)顯著下降［8］。而本研究中所鑒定出的兩種FABP與胰腺癌的關(guān)系尚不清楚，這也將是本課題組下一步工作的重點(diǎn)。

2號(hào)蛋白為肌酸激酶（creatine kinase，CK）M型，CK通常存在于動(dòng)物的心臟、骨骼肌及腦組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮、ATP的再生有直接關(guān)系的重要激酶。自1979年首次發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者血清中CK的含量顯著升高以來，在其他許多類型的癌癥患者中也發(fā)現(xiàn)各型CK的含量顯著升高［9］，近期研究更是發(fā)現(xiàn)CK肌肉型B（creatine kinase，muscle b，CKMB）顯著升高，且CKMB／CK倒置多傾向于考慮惡性腫瘤可能性大［10］。而通過篩選CK抑制劑尋找新的抗腫瘤藥物成為腫瘤研究一大熱點(diǎn)。藥物組顯著下調(diào)CK－M表達(dá)，很可能也是它非常重要的抑瘤通路。

6號(hào)蛋白為碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）3，CA是一族含鋅酶，廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)。CA在許多種惡性腫瘤中都有過表達(dá)，在不同腫瘤中表達(dá)的CA同工酶不同，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮很重要的作用［11］。Dai等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，CA3通過黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）信號(hào)途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞SK－Hep1的轉(zhuǎn)移和侵犯，而siRNA沉默CA3表達(dá)則可降低SK－Hep1細(xì)胞的侵襲能力，并認(rèn)為其機(jī)制為過表達(dá)的CAⅢ改變了細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外的pH值，進(jìn)而激活了FAK信號(hào)通路。馬兵等［13］的研究則發(fā)現(xiàn)CA抑制劑托毗酯可明顯減少荷瘤小鼠肺中的轉(zhuǎn)移灶數(shù)，最高轉(zhuǎn)移抑制率達(dá)81．25%。

本實(shí)驗(yàn)中用藥組顯著上調(diào)的蛋白是硒結(jié)合蛋白家族成員，硒是人體和動(dòng)物必需的微量元素，不能自行合成，是谷胱甘肽過氧化物酶、磷脂氫過氧化物酶等數(shù)種酶的必要成分。目前，已知25個(gè)人類基因編碼硒蛋白（selenoprotein）［14］，具有抗腫瘤、延緩衰老，抑制細(xì)胞分裂及腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，逆轉(zhuǎn)惡性表型的作用。硒蛋白的表達(dá)對(duì)生存至關(guān)重要，雖然不同硒蛋白功能各異，其生化基礎(chǔ)主要是硒蛋白的氧化還原活性。大量的研究表明血液中硒的含量過低會(huì)增加癌癥的患病機(jī)率［15］，補(bǔ)硒治療可以降低總體患者的病死率。硒蛋白抗腫瘤作用可能與其通過降低體內(nèi)過氧化物的積累、增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力等預(yù)防腫瘤有關(guān)［16］。

本實(shí)驗(yàn)中上調(diào)的2號(hào)蛋白為非組蛋白染色體蛋白（non－h(huán)istone chromosomal protein）高泳動(dòng)率組分（high mobility group，HMG－17）。HMG 蛋白是一種廣泛存在于真核生物染色質(zhì)內(nèi)的非組蛋白，因其相對(duì)分子質(zhì)量小，在聚丙烯酞胺凝膠電泳中遷移較快而得名。HMG蛋白由HMGA、HMGB和HMGN這三大家族組成。HMGN是一組與核小體結(jié)合的核蛋白，它在DNA損傷的染色質(zhì)改變中起著重要作用，它們能夠改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)染色質(zhì)模板的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，而DNA損傷是腫瘤形成和發(fā)展的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，HMGN2基因位于與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)的染色體1p區(qū)域，1p區(qū)域具有多個(gè)瘤抑制基因，1p36這一區(qū)域的染色體異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，HMG－17基因恰恰定位于1p36．1，提示該分子很可能與抵抗腫瘤生成有關(guān)［17］。淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（lymphokine activated killer，LAK）是指由白介素－2激活的、具有殺腫瘤活性的NK和T細(xì)胞，目前被認(rèn)為是機(jī)體抗瘤細(xì)胞系統(tǒng)和抗胞內(nèi)微生物感染的主要免疫細(xì)胞群體，LAK細(xì)胞也是臨床生物治療惡性腫瘤最為重要的細(xì)胞。LAK細(xì)胞抗瘤和抗微生物感染的效應(yīng)分子具有多樣性，華西醫(yī)學(xué)中心感染免疫研究室從人外周血分離培養(yǎng)的LAK細(xì)胞的酸溶性提取物中，篩選獲得一種能抗革蘭陰性菌的免疫活性肽分子，經(jīng)鑒定該肽分子是 HMG－17［18］。 即HMG－17作為L(zhǎng)AK細(xì)胞的一種效應(yīng)因子而發(fā)揮抗腫瘤的活性。劉西茜等［19］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)HMGN2蛋白可以明顯抑制人舌癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。綜上所述，HMGN2蛋白可以增強(qiáng)染色質(zhì)模板的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，作為具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的LAK細(xì)胞的一種效應(yīng)因子，這些都是其抗腫瘤的重要機(jī)制。由此推測(cè)，加味烏梅丸上調(diào)HMGN2蛋白的表達(dá)是其抗腫瘤機(jī)制中極為重要的一個(gè)。

從上述數(shù)據(jù)分析來看，加味烏梅丸的抑瘤是多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的，其中最主要的為 MLC2、A－FABP、CA3、硒結(jié)合蛋白、HMG－17，這些很可能是其發(fā)揮抗腫瘤活性的最主要靶點(diǎn)，這為研制抗胰腺癌藥物提供了重要的思路。這些差異蛋白的篩選、驗(yàn)證，所涉及的通路及相互之間的作用關(guān)系是本課題組下一步研究的重點(diǎn)。

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