鄭多多，王文思，楊中蘋，付曉萍，李凌飛

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明　650201）

云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中細(xì)菌的分離與分子鑒定

鄭多多，王文思，楊中蘋，付曉萍，李凌飛*

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201）

目的：為了明確云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中細(xì)菌的種類，對云南傳統(tǒng)發(fā)酵的豆豉進(jìn)行研究。方法：采用平板稀釋法進(jìn)行菌種分離，利用分子生物學(xué)方法對分離到的菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果：隨機(jī)選擇的130株細(xì)菌菌株屬于3個(gè)屬5個(gè)種，分別是芽胞桿菌屬（Bacillus）3個(gè)種、葡萄球菌屬（Staphylococcus）1個(gè)種和腸桿菌屬（Enterobacter）1個(gè)種。其中枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）占所分離菌株的79．23%，是云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉的優(yōu)勢菌。結(jié)論：分離出的枯草芽胞桿菌有望作為實(shí)現(xiàn)云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉純種發(fā)酵的主要菌種。

云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉；細(xì)菌；分子鑒定

［DOI］10．3969∕j．issn．1672-2345．2015．02．018

豆豉是以黑豆、黃豆為原料經(jīng)微生物發(fā)酵而制成的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。豆豉除含有人們熟悉的優(yōu)質(zhì)蛋白、必需脂肪酸外，在其加工過程中能生成多種有利人體消化吸收的發(fā)酵產(chǎn)物、提高了維生素B的含量，是純天然的功能性食品〔1〕。中醫(yī)認(rèn)為，豆豉具有解表清熱、透疹解毒的功效〔2〕。

微生物對豆豉的品質(zhì)及風(fēng)味形成起著至關(guān)重要的作用〔3〕。我國主要生產(chǎn)毛霉型、曲霉型及少量的細(xì)菌型豆豉〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)細(xì)菌型豆豉發(fā)酵的微生物主要有豆豉芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌〔5〕、乳酸菌和微球菌等。目前國內(nèi)豆豉的生產(chǎn)多以自然發(fā)酵為主，尚未實(shí)現(xiàn)純種發(fā)酵，存在生產(chǎn)方式落后、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定和食品安全（受致病菌污染）等問題。因而有必要加大科研開發(fā)力度，本研究以云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉為研究對象，對云南傳統(tǒng)豆豉發(fā)酵過程中的細(xì)菌種類、數(shù)量以及優(yōu)勢菌群進(jìn)行研究，分析探討可用于豆豉純種發(fā)酵的優(yōu)勢菌株。這對實(shí)現(xiàn)云南豆豉純種發(fā)酵，確保產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全性，推動云南豆豉產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1　材料與方法

1．1材料本實(shí)驗(yàn)的豆豉樣品采集自云南昆明、通海、建水等地，為云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；細(xì)菌DNA提取試劑盒（北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；Premix Taq（寶生物工程有限公司）；細(xì)菌通用引物799f∕1492r、BM2000 DNA Marker（上海超研生物科技有限公司）；Tris堿、鹽酸、冰乙酸、EDTA、瓊脂糖、超純水等。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1菌種的分離和純化根據(jù)《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789．2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》〔6〕，對云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中的細(xì)菌進(jìn)行分離純化。

1．2．2提取細(xì)菌基因組DNA從分離平板上隨機(jī)選擇130個(gè)細(xì)菌單菌落，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，方法參見試劑盒說明書。提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．316S rDNA的PCR擴(kuò)增以基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物799f（5′-AACAGGATTAG?ATACCCTG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTACGACTT-3′）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因序列。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×PremixTaq（TaKaRa）25 μL；引物（10 μM）各2 μL；DNA模板1 μL；用無菌去離子水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火1 min，72℃延伸70 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸7 min。用0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1．2．4測序及分析用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并送至賽音生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行DNA測序。所獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析。采用Mega 4．0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果

2．1云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中細(xì)菌的分離結(jié)果對云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中的細(xì)菌進(jìn)行分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-1～10-6稀釋度的平板上都長出了大量菌落。通過菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算得到豆豉樣品中含有1．55×107個(gè)∕g菌落。從中隨機(jī)選擇130個(gè)菌株純培養(yǎng)后進(jìn)行分子鑒定。

2．2菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果提取130株細(xì)菌的基因組DNA并以此為模板經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均得到約750 bp的DNA片段。

2．3菌株16S rDNA序列的分析將所獲得的130株細(xì)菌的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，選擇一些與測定序列同源性較高的已知種序列作為參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中的細(xì)菌分屬于3個(gè)屬5個(gè)種，分別是芽胞桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（En?terobacter）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）。其中芽胞桿菌屬包括枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）和短小芽胞桿菌（Bacillus pumilus）；腸桿菌屬為產(chǎn)氣腸桿菌（Entero?bacter aerogenes）；以及葡萄球菌屬中一個(gè)尚不能確定具體種類的種（Staphylococcus sp．）。見圖1。

圖1　云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中細(xì)菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

NCBI比對相似性均在99．00%以上，芽胞桿菌（Bacillus）是云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中細(xì)菌的優(yōu)勢屬，占所分離細(xì)菌菌株的95．39%，其中枯草芽胞桿菌（Ba?cillus subtilis）占79．23%，是云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中的優(yōu)勢菌。見表1。

表1　云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中各種細(xì)菌所占比例（n=130）

3　討論

長期以來，對細(xì)菌的分類鑒定主要依靠菌落形態(tài)以及大量生理生化反應(yīng)（比如糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)等）鑒定，這種傳統(tǒng)鑒定技術(shù)不僅花費(fèi)時(shí)間長，而且準(zhǔn)確性不夠高，是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸。隨著分子生物學(xué)和PCR技術(shù)的發(fā)展，16S rDNA鑒定技術(shù)在細(xì)菌鑒定方面得到應(yīng)用，其鑒定指標(biāo)單一明確，以細(xì)菌保守序列為基準(zhǔn)，進(jìn)行同源性分析，通過序列差異鑒定種屬，具有準(zhǔn)確、快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。正成為我國在傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物研究等方面的關(guān)鍵技術(shù)。

豆豉的品質(zhì)、生理功能特性與微生物息息相關(guān)，豆豉風(fēng)味、色澤和生理功能的形成多是依靠微生物發(fā)酵及其代謝產(chǎn)生的多種酶系。國內(nèi)對細(xì)菌型豆豉的研究主要集中在菌種篩選和發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面，前人研究發(fā)現(xiàn)參與細(xì)菌型豆豉發(fā)酵的微生物主要有豆豉芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、乳酸菌和微球菌等。

目前關(guān)于云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中細(xì)菌的研究鮮見報(bào)道，只有昆明理工大學(xué)等人對豆豉中乳酸菌進(jìn)行了研究，研究表明云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中優(yōu)勢發(fā)酵乳酸菌主要為Lactobacillus sp．，Weissella sp．和Pediococcus sp．3個(gè)種屬的乳酸菌〔7〕。乳酸菌通常是在豆豉后發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，其基本不參與豆豉的初期發(fā)酵。因此，目前對于參與云南傳統(tǒng)豆豉初期發(fā)酵的微生物知之甚少。本研究以云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉為研究對象，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)方法相結(jié)合，對云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定。避免了傳統(tǒng)生理生化鑒定繁雜且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性不高的缺點(diǎn)。

本研究的結(jié)果表明，芽胞桿菌屬是云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中的優(yōu)勢屬，其中枯草芽胞桿菌占絕對優(yōu)勢（79．23%）。枯草芽胞桿菌是工業(yè)微生物的主力軍之一，也是目前用于細(xì)菌型豆豉發(fā)酵的主要微生物?？莶菅堪麠U菌被美國食品和藥品監(jiān)督局認(rèn)為是GRAS（Generally regarded as safe，食品添加劑安全性評價(jià)指標(biāo)）〔8〕，它是一些重要的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品如印度的Kinema、泰國的Thua-nao和西非的Daddawa中的優(yōu)勢菌〔9〕。早在日本平安時(shí)代日本人就已經(jīng)利用枯草芽胞桿菌在大豆中采用固態(tài)發(fā)酵的方法生產(chǎn)納豆，開創(chuàng)了利用枯草芽胞桿菌的歷史。研究資料表明，枯草芽胞桿菌具有豐富的酶系，能夠產(chǎn)生蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶、木聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、谷氨酰胺酶等十幾種酶〔10〕。這是豆豉中其他參與發(fā)酵菌種無法比擬的?？莶菅堪麠U菌能產(chǎn)出黏性物質(zhì)、其發(fā)酵產(chǎn)物納豆具有抗菌、溶血栓、抗癌等功能，枯草芽胞桿菌還具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)物豐富、可利用開發(fā)價(jià)值高以及作為食品、藥品安全性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究分離到的枯草芽胞桿菌有望作為實(shí)現(xiàn)細(xì)菌型豆豉純種發(fā)酵的主要菌種。

地衣芽胞桿菌的作用機(jī)制是以菌治菌，活菌進(jìn)入腸道后，對葡萄球菌、酵母菌等致病菌有拮抗作用，然而對雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、消化性鏈球菌具有促進(jìn)生長作用，從而達(dá)到可調(diào)整菌群失調(diào)達(dá)到治療目的〔11〕。

短小芽胞桿菌屬于芽胞桿菌屬，能水解淀粉，利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸，利用丙酸鹽，還原硝酸鹽，分解酪氨酸。邱秀寶研究發(fā)現(xiàn)短小芽胞桿菌能夠產(chǎn)生堿性蛋白酶〔12〕。

本研究還從豆豉中分離到了葡萄球菌屬的細(xì)菌。葡萄球菌屬的細(xì)菌是一群革蘭氏陽性球菌，分布十分廣泛。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的葡萄球菌有30多種，大多數(shù)是不致病的腐生菌。葡萄球菌生化反應(yīng)活潑，多數(shù)菌株能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣〔13〕。國內(nèi)外已有報(bào)道不同種葡萄球菌（包括木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、肉葡萄球菌和模仿葡萄球菌）均可作為肉制品發(fā)酵劑并加以應(yīng)用。趙振玲等在篩選葡萄球菌作為發(fā)酵劑香腸的研究中發(fā)現(xiàn)木糖葡萄球菌具有抗菌活性，且能水解蛋白質(zhì)〔14〕。

此外，云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中還存在極少數(shù)的產(chǎn)氣腸桿菌。產(chǎn)氣腸桿菌屬于腸桿菌科腸桿菌屬，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)乳酸，對蔗糖的轉(zhuǎn)化率較高且轉(zhuǎn)化速率快，具有較好的應(yīng)用前景〔15〕。產(chǎn)氣腸桿菌主要生存于人類和動物的腸道，亦生存于水、土壤及腐敗物中，為人體內(nèi)的正常菌相，只有在人體虛弱的特殊情況下才偶爾引起疾病。研究表明，在傳統(tǒng)中式發(fā)酵香腸體系中產(chǎn)氣腸桿菌和陰溝腸桿菌存在協(xié)同作用，促進(jìn)彼此生長，同時(shí)也增加它們產(chǎn)生物胺的能力〔16〕。生物體內(nèi)適量的生物胺可促進(jìn)正常生理活動，而過量的生物胺會導(dǎo)致生物體產(chǎn)生不良反應(yīng)。生物胺已成為世界公認(rèn)的對人體健康有潛在危害的物質(zhì)。雖然本研究中產(chǎn)氣腸桿菌所占比例僅為0．77%，不至于產(chǎn)生過量的生物胺，但仍然存在一定的食品安全隱患。

本研究的結(jié)果表明，枯草芽胞桿菌是云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中的優(yōu)勢菌。我們用枯草芽胞桿菌對豆豉進(jìn)行了純菌種發(fā)酵初步研究，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對豆豉的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)實(shí)現(xiàn)了云南豆豉的純菌種發(fā)酵，純種發(fā)酵的豆豉在外觀、氣味、口感等方面與自然發(fā)酵相近?？梢?，枯草芽胞桿菌可以作為實(shí)現(xiàn)云南細(xì)菌型豆豉純種發(fā)酵的主要菌種來使用，對于今后進(jìn)一步優(yōu)選、優(yōu)化生產(chǎn)菌種，實(shí)現(xiàn)豆豉的純菌種發(fā)酵，有目的控制發(fā)酵方向，將豆豉生產(chǎn)向工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化方向轉(zhuǎn)變，提高產(chǎn)品質(zhì)量等方面有著重要的意義。

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（責(zé)任編輯李楊）

Isolation and Molecular Identification of Bacteria from Yunnan Traditionally Fermented Douchi

Zheng Duoduo,Wang Wensi,Yang Zhongping,Fu Xiaoping,Li Lingfei*
（College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China）

Objective:To study Yunnan traditionally fermented Douchi and to identify kinds of bacteria in it．Methods:The bacteria were isolated from Douchi by the dilution method,and 130 strains of bacteria were randomly selected and identified by the molecular methods．Results:130 strains isolated belonged to 3 genera and 5 species,including 3 species of the genus Bacillus,1 species of the genus Staphylococcus,and 1 species of the genus Enterobacter．Bacillus subtilis accounting for 79．23%was the dominant species of all the bacteria from Yunnan traditionally fermented Douchi．Conclusion:Bacillus subtilis was expected as the main strain for Yunnan Douchi to be purely fermented．

Yunnan traditionally fermented Douchi;bacteria;molecular identification

TS214．2

A

1672-2345（2015）02-0060-04

云南省教育廳基金資助項(xiàng)目（2012Y372）；云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金資助項(xiàng)目（2014ZKX065）

2014-10-28

2014-11-10

鄭多多，碩士研究生，主要從事食品微生物及分子生物學(xué)研究．

李凌飛，副教授，博士．