蠟樣芽孢桿菌烯醇還原酶基因的克隆、表達和酶學(xué)性質(zhì)研究

應(yīng)向賢，李國四，范雅君，胡寶軍，汪 釗

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

引言

烯醇還原酶（enone/enoatereductases，EC1.6.99.1）又稱老黃酶（old yellow enzyme），是一類可以利用NADH或NADPH對α,β-不飽和C=C雙鍵進行雙鍵加氫的氧化還原酶。烯醇還原酶可以在不對稱還原C=C反應(yīng)中同時引入兩個手性中心，該反應(yīng)是合成許多手性精細化工品的必要步驟，因此近年來受到廣泛關(guān)注。烯醇還原酶通過分別轉(zhuǎn)移還原態(tài)FMN中和水分子中的[H]到底物的Cβ與Cα上完成底物的反式加氫[1-2]，而以金屬催化劑為媒介的化學(xué)催化以底物C=C的順式加氫更為常見[3-4]。這種獨特的反式加氫使得烯醇還原酶成為現(xiàn)有的化學(xué)催化C=C加氫的重要補充?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)烯醇還原酶能夠催化多種活潑烯烴的還原，包括α,β-不飽和醛酮、硝基烯、羧酸以及他們的衍生物（酯，內(nèi)酯，環(huán)胺，酸酐）[5-8]。烯醇還原酶作為生物催化劑在生物催化中的應(yīng)用主要是整細胞催化法[9-12]，然而目前整細胞催化活性低，而且胞內(nèi)羰基還原酶的存在降低了整細胞對α,β-不飽和羰基化合物中C=C和C=O鍵的化學(xué)選擇性[11-12]。與整細胞催化法相比，酶法催化C=C加氫具有高活性和高立體選擇性等優(yōu)點，可以有效克服整細胞催化法的缺點，因而對烯醇還原酶及其酶法催化的研究越來越受矚目[13-16]。

本研究以實驗室保藏菌株Bacillus cereus WZY004為出發(fā)菌株，對其基因組中的烯醇還原酶基因進行了克隆和表達，并利用親和層析實現(xiàn)了重組烯醇還原酶的分離純化。在此基礎(chǔ)上，研究了該重組酶的酶學(xué)性質(zhì)，如最適pH、最適溫度、熱穩(wěn)定性、底物特異性等，為其在C=C加氫上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

蠟樣芽孢桿菌WZY004（B.cereus WZY004）為實驗室保藏菌株。宿主菌大腸桿菌E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）為實驗室已有資源。表達載體pEASY-E1購自于北京全式金（TransGen Biotech）生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和dNTPs購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。用于基因組提取、質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物純化和DNA膠回收的試劑盒均購自大連TaKaRa公司。輔酶NADH購自上海申能博彩公司。

1.1.3 引物

根據(jù)已知Bacillus cereus ATCC 14579基因組中烯醇還原酶基因（AE016877.1）設(shè)計PCR擴增烯醇還原酶基因的引物為：上游引物5'-TTGATGAATTCCAAGCTTTTTTC-3'，下游引物 5'-TTATTTATTCGTATGAATTTTTCCTG-3'。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，用NaOH將pH調(diào)至7.0。固體培養(yǎng)基添加2.0%的瓊脂。培養(yǎng)基于121°C下滅菌20 min。

LB/Amp培養(yǎng)基：滅菌后的LB培養(yǎng)基加入終濃度為 100 μg/mL的氨芐青霉素（Amp）。

1.2 方法

1.2.1 烯醇還原酶Bac-OYE基因的克隆

PCR擴增烯醇還原酶基因以B.cereus WZY004基因組DNA為模板，擴增條件為：94°C預(yù)變性4 min；94 °C 變性 30 s，55 °C 復(fù)性 30 s，72 °C 延伸 1 min，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為 30；72°C后延伸 10 min。擴增后的產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。純化后的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-E1表達載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μL Trans1-T1感受態(tài)細胞中，具體操作參照pEASY-E1 Expression Kit說明書。利用菌落PCR方法鑒定陽性克隆子，取鑒定正確的克隆子送至上海桑尼生物科技有限公司測序。將測序所得的基因與GenBank中對應(yīng)的基因序列進行比對分析，將含有正確片段的質(zhì)粒命名為pEASY-E1-OYE。

1.2.2 重組烯醇還原酶Bac-OYE的表達和純化

用質(zhì)粒提取試劑盒從Trans1-T1菌體中提取重組質(zhì)粒pEASY-E1-OYE，取10 μL將其轉(zhuǎn)入200 μL E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，并涂布于LB/Amp抗性平板上37°C下培養(yǎng)過夜。挑取陽性菌株單菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中在30°C和200 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)12 h，作為種子液。然后按1%接種量擴大培養(yǎng)接種至150 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C和200 r/min下培養(yǎng)至菌液濃度（OD600）約為 0.6～0.8 時，添加誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至終濃度為0.2 mmol/L，在25°C和200 r/min下繼續(xù)培養(yǎng)8～10 h過量表達目的蛋白。誘導(dǎo)完成后10000 r/min離心10 min收集菌體，超純水清洗并重懸菌體，然后在冰浴條件下超聲破碎細胞。超聲破碎細胞條件為：工作時間2 s，間歇時間5 s，破碎總工作時間為40 min。細胞破碎液在4°C下12000 r/min離心10 min，收集上清；相同離心條件下重復(fù)離心3次。將收集到的上清液進行Ni-NTA親和層析獲取目的蛋白，收集到的目的蛋白經(jīng)超濾濃縮脫鹽后，進行SDS-PAGE檢測（丙烯酰胺濃度為13.5%）并測定蛋白濃度。分裝Bac-OYE純酶保存于-20°C冰箱備用。

1.2.3 重組烯醇還原酶Bac-OYE的酶學(xué)性質(zhì)研究

酶活力的測定在96微孔板中進行，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系總體積為200 μL，分別包含10 mmol/L的氧代異佛爾酮、0.4 mmol/L 的 NADH、100 μg/mL 的純酶，50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液。反應(yīng)在pH 7.5和40°C下進行，通過最終加入NADH啟動反應(yīng)，通過檢測1 min內(nèi)在340 nm下NADH吸光值的降低來確定酶活大小。NADH的摩爾消光系數(shù)為 6.22×103M-1cm-1，一個酶活力單位（U）定義為每分鐘消耗1 μmol NADH所需的酶量。Bac-OYE對底物氧代異佛爾酮的動力學(xué)參數(shù)測定方法按照上述酶活性分析方法進行，其中氧代異佛爾酮的濃度范圍為0.25～10 mmol/L。采用雙倒數(shù)法計算重組烯醇還原酶Bac-OYE以氧代異佛爾酮為底物時的Km和Vmax。

通過測定不同pH緩沖液中Bac-OYE的酶活確定該蛋白的最適pH。采用的緩沖液分別為Tris-HCl緩沖液 （pH 7.0～9.0）和檸檬酸緩沖液（pH 4.0～7.2）。最適溫度通過測定不同溫度下的酶活來確定，溫度范圍為25～70°C，5°C為一個間隔。

為了測定重組烯醇還原酶Bac-OYE的熱穩(wěn)定性，一定濃度的酶溶液在不同溫度下孵育120 min，每20 min取樣一次，檢測Bac-OYE在不同條件下的殘余活力。以孵育前的酶活力為100%計算相對酶活力。

為了測定重組烯醇還原酶Bac-OYE底物特異性，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)還原體系中，分別添加不同的α,β-不飽和羰基化合物作為底物，在最適反應(yīng)條件下檢測重組酶對不同底物的催化效果。以對氧代異佛爾酮的活力為100%，其他底物以此計算相對酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組烯醇還原酶Bac-OYE的表達和純化

蠟樣芽孢桿菌WZY004基因組DNA中的重組烯醇還原酶Bac-OYE基因經(jīng)PCR擴增后，通過TA連接的方式連接至表達載體pEASY-E1上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pEASY-E1-OYE。將重組質(zhì)粒pEASY-E1-OYE轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coli BL21（DE3）。在IPTG誘導(dǎo)下，重組烯醇還原酶Bac-OYE在E.coli BL21（DE3）中以可溶蛋白形式過量表達。利用重組質(zhì)粒攜帶的多組氨酸標(biāo)簽，表達的重組酶經(jīng)Ni2+親和色譜分離純化。純化的重組酶經(jīng)SDS-PAGE檢測為單一條帶（圖1），實現(xiàn)了重組蛋白的一步純化。該重組酶分子量約為38.2 kD，與預(yù)期相符。經(jīng)過酶活力和蛋白質(zhì)濃度測定，計算得該重組酶的比活力為0.72 U/mg。

圖1 重組烯醇還原酶Bac-OYE純化前后的SDS-PAGE分析

2.2 酶促動力學(xué)參數(shù)測定

對不同濃度氧代異佛爾酮進行酶活力測定，根據(jù)測定結(jié)果進行雙倒數(shù)曲線擬合（圖2）。曲線擬合度R2=0.99411，擬合方程為y=0.54659x+0.8859，根據(jù)擬合曲線計算得到Bac-OYE對氧代異佛爾酮的Km和Vmax分別為1.83 mmol/L與1.13 U/mg。測定時發(fā)現(xiàn)Bac-OYE能同時利用NADH和NADPH，但更傾向于利用NADH為輔酶。以NADH為輔底物時比酶活是NADPH的1.5倍。

2.3 最適pH和最適溫度

純化后的 Bac-OYE在 pH 7.0～8.0的 Tris-HCl緩沖液中活力較高，在pH 7.5的Tris-HCl緩沖液中活力達到最高 （圖3）。Bac-OYE在溫度30～60°C范圍內(nèi)酶活緩慢升高并且在60°C時達到最大，而當(dāng)溫度超過60°C后，酶活迅速降低，在70°C時酶完全失活（圖4）。

圖2 重組烯醇還原酶Bac-OYE的雙倒數(shù)曲線

圖3 pH對重組烯醇還原酶Bac-OYE酶活力的影響

圖4 溫度對重組烯醇還原酶Bac-OYE酶活力的影響

2.4 熱穩(wěn)定性

純化后的Bac-OYE的熱穩(wěn)定性研究表明，在溫度40°C和45°C孵育2 h后其活力基本保持不變。而50°C孵育1 h后酶活就迅速下降，2 h后酶活基本消失。60°C酶極不穩(wěn)定，20 min后酶活損失接近50%，1 h后完全失活（圖5）。

2.5重組烯醇還原酶Bac-OYE的底物特異性

圖5 重組烯醇還原酶Bac-OYE的熱穩(wěn)定性

以α,β-不飽和醛酮及其衍生物為底物，研究了重組烯醇還原酶Bac-OYE的底物特異性。以Bac-OYE對氧代異佛爾酮的比酶活為100%，計算Bac-OYE對所有底物的相對活力（表1）。Bac-OYE對氧代異佛爾酮及其衍生物的活力相差很大，只對氧代異佛爾酮表現(xiàn)出活力，而對4號位沒有酮基的衍生物（如異佛爾酮、4-羥基異佛爾酮、3-環(huán)己烯-1-酮）不表現(xiàn)活力，由此推測4號位酮基對酶活力具有重要作用。該重組酶對于直鏈化合物上的α,β-不飽和C=C雙鍵均表現(xiàn)出活力，尤其對檸檬醛、2-甲基-2-戊烯醛和反式-2-癸烯醛表現(xiàn)出較高活力。對于環(huán)狀化合物側(cè)鏈上的α,β-不飽和C=C雙鍵，Bac-OYE只對肉桂醛有較低活力。同時該酶對馬來酰亞胺表現(xiàn)出較高活力而對其結(jié)構(gòu)類似物馬來酸酐不表現(xiàn)活力。此外，對α,β-不飽和醛酮的衍生物肉桂酸甲酯也有和對氧代異佛爾酮相似的活力。

表1 重組烯醇還原酶Bac-OYE的底物特異性

3 結(jié)論

本研究以實驗室保藏菌株Bacillus cereus WZY004的基因組為模板，成功克隆、表達并純化出了一種烯醇還原酶Bac-OYE。該酶可以同時利用NADH和NADPH作為輔酶，但更傾向于NADH。對Bac-OYE的底物特異性分析發(fā)現(xiàn)其對鏈狀α,β-不飽和醛具有較高活力，尤其是檸檬醛、2-甲基-2-戊烯醛以及反式-2-癸烯醛。目前對于α,β-不飽和醛酮以及其衍生物的不對稱還原主要集中在化學(xué)方法上，區(qū)域選擇性和立體選擇性不高，本研究的結(jié)果可以作為化學(xué)加氫方法的補充。

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