孫念, 陳開建, 褚武英, 肖調(diào)義, 李迪

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草魚原肌球蛋白基因的克隆及其組織表達

孫念1, 陳開建1, 褚武英2, 肖調(diào)義1, 李迪1

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院, 湖南長沙, 410003; 2. 長沙學院生物工程與環(huán)境科學系, 湖南長沙, 410003)

為揭示原肌球蛋白基因在草魚肌肉中的作用, 利用RT-PCR和RACE技術克隆獲得了草魚原肌球蛋白基因cDNA, 并對該基因在普通草魚和脆肉鯇不同組織中的表達情況進行研究分析。結果表明原肌球蛋白基因cDNA全長序列為1 705 bp, 包含387 bp的5′UTR序列, 1 307 bp的3′UTR序列和855 bp開放閱讀框(ORF)。其ORF編碼284個氨基酸。系統(tǒng)進化分析表明普通草魚與斑馬魚、墨西哥脂鯉的原肌球蛋白基因核苷酸同源性分別是93％和87％, 氨基酸同源性分別是96％和93％。在聚類上普通草魚原肌球蛋白基因與其他鯉科魚類同源性較高, 表明親緣關系最近, 與傳統(tǒng)分類相一致。Real time-PCR結果表明原肌球蛋白基因在所檢測的普通草魚和脆肉鯇7個組織中均有表達, 原肌球蛋白基因在普通草魚腹肌中表達最高, 其次為前腸。原肌球蛋白基因在脆肉鯇腹肌中的表達低于普通草魚, 而脆肉鯇中肌肉、肝臟、腎臟、前腸、后腸中原肌球蛋白基因表達量大于普通草魚相對應組織, 但差異不顯著。

普通草魚; 原肌球蛋白; 基因表達; 脆肉鯇

作為一類結合蛋白,原肌球蛋白(tropomyosin,TPM)在細肌絲中能與肌動蛋白絲結合并與肌鈣蛋白一起參與調(diào)節(jié)肌球蛋白與肌動蛋白絲對鈣離子的相互作用。Perry[1]、楊靜嫻[2]等發(fā)現(xiàn)TPM以大量異構體形式行使著真核細胞內(nèi)與肌動蛋白細肌絲相關的多種功能, 這是由于TPM作為一類異構體形式廣泛存在于真核細胞中。這些TPM異構體共享結構形式, 大部分的同源異構體在分布上具有組織肌絲特異性, 被表達的外顯子和其相應的分子區(qū)域對其相關肌絲的功能表達具有重要意義。TPM二聚化的螺旋結構使其在甲殼類和軟體動物中具有高度保守性[3-5], 也成為肌肉收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì), 同時又是甲殼類和軟體動物類主要的交叉過敏原[6-8]。目前國內(nèi)關于原肌球蛋白基因的研究報道不多, 李忻怡[9]等研究表明TPM在維持魚類成體的生命活動過程中發(fā)揮重要作用, 其參與文昌魚胚胎軀體模式的構建, 文昌魚的肌節(jié)、肌肉調(diào)節(jié)及神經(jīng)索的發(fā)生也與TPM的表達相關。李荔[10]等成功克隆出斑馬魚() TPM基因, 經(jīng)免疫學鑒定發(fā)現(xiàn)其具有免疫過敏原的特性。不僅僅存在于肌肉細胞中, TPM也廣泛并少量的存在于非肌肉細胞中, 而不同的細胞類型中同源異構體性質(zhì)不同, 使得TPM在肌肉和非肌肉組織中功能不同, 包世新[11]等通過研究TPM在膀胱癌中的表達, 發(fā)現(xiàn)TPM有望成為一類腫瘤標記物。李晨陽[12]等發(fā)現(xiàn)TPM功能研究有助于提示瘢痕攣縮的發(fā)生機制。

選取規(guī)格較大的普通草魚()飼喂3個月或半年以上浸泡了的蠶豆后就成了脆肉鯇, 即肉質(zhì)脆化了的草魚, 其肉質(zhì)緊致脆爽, 不易碎。通過構建草魚cDNA文庫, 發(fā)現(xiàn)與普通草魚脆化相關的重要蛋白原肌球蛋白在普通草魚和脆肉鯇間存在表達差異顯著。鑒于TPM在調(diào)控骨骼肌細肌絲活動及免疫方面的重要作用和功能, 本文對草魚TPM基因開展克隆并對其進行表達分析研究, 為進一步對研究脆化草魚脆化機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

普通草魚和脆肉鯇從湘鄉(xiāng)市養(yǎng)殖場運至湖南農(nóng)業(yè)大學實驗室水池暫養(yǎng), 正常飼喂2周后開始試驗。取材時先用丁香油麻醉, 選擇同樣規(guī)格的普通草魚和脆化草魚各3尾。取不同組織后迅速丟置液氮中冷藏, 于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 TPM cDNA克隆

1.2.1 總RNA提取

迅速取出冷凍的普通草魚和脆肉鯇肌肉組織于研缽中, 在液氮下研磨成粉末狀。然后按照RNA iso Plus(Takara, Japan)說明書提取總RNA。

1.2.2 TPM cDNA部分序列片段克隆

根據(jù)GenBank已有報道的魚類TPM cDNA保守序列片段設計2對引物, 克隆出2段中間片段。用肌肉中提取的總RNA為模板, 照反轉錄試劑盒(Clontech, USA)的說明合成第1條cDNA鏈, 再進行PCR擴增, 其反應體系如表1所示。

表1 反應體系

反應程序為94 ℃預變性5 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 35個循環(huán)。3%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物, 采用天頌生物公司的凝膠回收試劑盒純化, 連接到pUCm-T載體并轉染感受態(tài)細胞, 用于克隆測序篩選。

1.2.3 快速擴增TPM4a cDNA末端

根據(jù)1.2.2中獲得的TPM中間片段和已設計好的特異性引物, 3’和5’RACE按照天頌生物公司試劑盒說明書進行擴增。3’RACE和5’RACE的特異性引物見表2。第1輪PCR反應條件為: 95 ℃3 min進行升溫; 94 ℃30 s預變性, 59 ℃40 s退火, 共35個循環(huán)；72 ℃10 min延伸。第2輪PCR以第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍為模板, 將TPM-F1引物替換為TPM-F2, TPM-R1引物替換為TPM-R2, 對獲得的3’RACE和5’ RACE產(chǎn)物分別轉染Top10感受態(tài)細胞, 篩選陽性克隆, 對陽性菌落進行測序。

表2 本實驗所用引物

1.3 TPM基因序列比對與分子進化樹分析

將擴增出的TPM cDNA中間片段和3’, 5’末端序列進行拼接, 得到TPM cDNA全長序列。根據(jù)ExPASy(http://www.expasy.ch/ tools/)軟件預測分析TPM氨基酸序列理化性質(zhì)并分析TPM蛋白二級結構。采用DNA star軟件對普通草魚和已知的3個其他魚類的TPM4a氨基酸序列(表3)進行同源性比對,并用BioEdit軟件構建鄰接(Neighbour- Joining, NJ)進化樹。

表3 用于構建系統(tǒng)進化樹的8個魚類的TPM4a氨基序列登錄號

1.4 TPM的組織表達差異

β-Actin作為內(nèi)參照(引物), 用RT-PCR檢測法檢測TPM蛋白基因在草魚不同組織的表達差異。Real-time PCR所用引物見表2。普通草魚和脆肉鯇魚各3尾, 麻醉解剖后取背肌、腹肌、尾肌、肝臟、腎臟、前腸和后腸等組織, 分別提取總RNA后反轉錄獲得cDNA模板。用SYBR染料法在RT-PCR儀(ABI Prism 7300)上進行RT-PCR擴增和數(shù)據(jù)分析。反應體系見表4。

表4 RT-PCR反應體系

每種樣品的目的基因和內(nèi)參照基因均設有3個重復, 同時設置陰性對照。所有加樣操作均在超凈工作臺上進行。反應程序為: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 32 s, 45個循環(huán)。擴增曲線和熒光值由ABI Prism 7300 SDS軟件分析。用雙標準曲線法計算目的基因相對于內(nèi)參基因的表達量。并用SPSS 17.0進行顯著性分析, 用Excel作圖。

1.5 統(tǒng)計分析

TPM mRNA的相對表達量采用雙標準曲線法分析進行差異性顯著檢驗。最終數(shù)據(jù)采用±表示,< 0.05時被認為TPM基因在2種魚中的表達呈顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 TPM基因的克隆及序列分析

采用同源克隆和RACE技術克隆出了普通草魚原肌球蛋白基因TPM全長序列。該全長序列為1 705 bp, 包含387 bp 的5’UTR 序列, 1 307 bp的3’UTR序列, 855 bp開放閱讀框, 編碼284個氨基酸(圖1)。

通過在線網(wǎng)站http://web.expasy.org/protparam/分析原肌球蛋白TPM的氨基酸序列, 該蛋白分子量為32 685.6, 理論等電點pI為4.68, 呈弱酸性。負電荷氨基酸殘基總數(shù)為80(天冬氨酸+谷氨酸)。正電荷氨基酸殘基總數(shù)為52(精氨酸+賴氨酸)。分子式為C1390H2319N391O491S10。ProtParam在線預測此蛋白不穩(wěn)定指數(shù)(II)被計算為44.28, 這個蛋白是不穩(wěn)定的, 脂肪指數(shù)是81.90, 平均親水性是-1.063。由組成分布及含量可知TPM蛋白由20種氨基酸組成。其中谷氨酸含量最高, 達21.5%。其次是賴氨酸和亮氨酸, 含量分別為13.3%和12.0%。所占含量百分比最少的是苯丙氨酸, 只有0.4%。

使用SWISS-MODEL在線程序對普通草魚TPM的氨基酸序列進行三級結構同源建模, 參與模型構建的氨基酸范圍為1～283aa, TPM蛋白序列與所參考生物模板序列比對同源性為80.57%, 模型評估值為0, 說明此蛋白三級模型結構可靠。該模型中總共包括277個α螺旋, 7個無規(guī)則卷曲。

2.2 TPM氨基酸序列同源性及分子進化分析

TPM基因cDNA序列于DNAstar軟件中尋找開放閱讀框并翻譯成氨基酸序列。將目標基因氨基酸序列置于NCBI進行核苷酸及氨基酸序列同源性比對, 查找同源蛋白序列。普通草魚TPM與斑馬魚()、墨西哥脂鯉()的草魚TPM核苷酸同源性分別是93％和87％, 氨基酸同源性分別是96％和93％。普通草魚與鯉魚和鳙魚的氨基酸同源性分別是92％和98％。

1ACATGGGGGTTTGCAGGCAGCATCAGCTGCATTCTTCTTCTCTC 45CTAAATCTCCTAGCATCCATTAGTCTGACCACACTTTCAGCTGAAGGACCAAGAACTGCA 105CTTCGTTCGTAGCTCCCTTGAATTTCATATTCGACCCAGACACTAGATCAACCTGCAACC 165ATGGAGGCCATCAAGAAGAAGATGCAGATGCTCAAACTGGACAAGGAGAACGCCATCGAC 1MEAIKKKMQMLKLDKENAID 225CGGGCAGAGCGGGCCGAGACGGAACAGAAAGCTGCTGAGGAAAAATGCAAGCAGCTGGAC 21RAERAETEQKAAEEKCKQLD 285GACGAGCTGGTCAGCTTGCAGAAAAAGCTCAAACAAACTGAAGATGAACTGGACAAGTAC 41DELVSLQKKLKQTEDELDKY 345TCAGAGGCCCTGAAAGATGCTCAGGAGAAACTTGAACTGTCTGAGAAAAAAGCTGCTGAC 61SEALKDAQEKLELSEKKAAD 405GCTGAGGGTGATGTGGCGGGCCTGAACCGCAGAATTCAGCTGGTGGAGGAGGAACTGGAT 81AEGDVAGLNRRIQLVEEELD 465CGGGCTCAGGAGAGGCTGGGAACTGCACTGCAAAAACTGGAAGAGGCGGAGAAAGCAGCA 101RAQERLGTALQKLEEAEKAA 525GACGAGAGCGAGAGAGGCATGAAGGTAATTGAGAACCGCGCCATGAAGGACGAAGAGAAG 121DESERGMKVIENRAMKDEEK 585ATGGAGATCCAGGAGATGCAGCTGAAAGAGGCCAAACACATCGCAGAGGAGGCCGACCGC 141MEIQEMQLKEAKHIAEEADR 645AAATATGAAGAGGTGGCCCGTAAACTGGTGATTCTCGAGGGTGAGCTGGAGCGAGCTGAG 161KYEEVARKLVILEGELERAE 705GAGAGAGCCGAAGTCGCTGAATGCAAAGCTAGTGATTTGGAGGAGGAATTGAAAAACGTT 181ERAEVAECKASDLEEELKNV 765ACCAACAACCTTAAATCCCTAGAGGCTCAGGCAGAGAAATACTCGGAAAAAGAAGACAAG 201TNNLKSLEAQAEKYSEKEDK 825TATGAAGAGGAAATCAAAGTTCTTAGTGACAAGCTGAAGGAGGCCGAGACCCGTGCAGAG 221YEEEIKVLSDKLKEAETRAE 885TTTGCAGAGAGGTCGGTGGCCAAACTGGAAAAATCTATCGATGACCTGGAAGAAAAATTA 241FAERSVAKLEKSRDDLEEKL 945TCTTCTGCAAAAGAAGAAAACCTCGGAATGCATCAAGTGCTGGATCAGACACTTCAGGAG 261SSAKEENLGMHQVLDQTLQE 1005CTGAACAGCTTATAAGAGACGATGAGAGAGAACCACGTCCATTTTTACAACATTCCACAA 281L N S L * 1065ATACTCTCCTTAATTCCAACTCGCAAGCTATTGAGCCCTATTTTCTCACAGAAAAAAAAA 1125TAATTTAATTTTTTGGTCTGAGGTATTTCTTTTGCGCTTTTATCCAAGTTGGCTCGACAT 1185CGCTTCTTTCAAAAGTTAGCCAAACAACCCGAGGTGCTAATTTCCCCACTGATACAACGT 1245TATAAGTAGCTTAACACATGACTTACCACATGGAAAGTGAATATGTTTGTGTGCCTCAGC 1305ATTTCAAGTTTTGATATTAATGTATCCCGGTCAATTAAAGACGTCAATGAAGGCGTTTTC 1365AGTGCCGTGTTTTTCATAAGTACATCATGCGCTCCATTTACTGGCCACATGATGCATTGC 1425AGTACATTACTTTATTGATAATGCGATGGTATTTTGGACATGCACCATAGTACCCCGGTA 1485GCATTTGTCAAAGTGCCTGTGTGTTTTTGTGGAACCACCACGAAATGGGACCAAACAAGG 1545ACCAAAGAAATATTAGCTTTTCCCTTTTTTCTGTGAATGCGTTGTCGCTTTTTTTCTGTC 1605AAATGACTATTTCAAAATGCCTCAAATGTTTTTTTTCCATTTTCTGTGTAATAAATTTTT 1665ATAAAAAGTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

用BioEdit軟件構建草魚TPM基因的系統(tǒng)進化樹(圖2)。設置重復抽樣次數(shù)為1 000,從進化樹可以看出,亞馬遜花鱂(-)TPM基因與劍尾魚()TPM基因首先聚類, 然后與尼羅羅非魚()TPM基因與伯氏樸麗魚()TPM基因聚類的分支聚類, 再與紅麗魚()TPM基因聚類, 再與草魚TPM基因與斑馬魚TPM基因聚類后的分支聚類, 最后與墨西哥脂鯉TPM基因聚類。系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明, TPM基因的進化與物種的進化方向一致。

圖2 TPM氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進化樹

2.3 普通草魚和脆肉鯇不同組織TPM表達差異

根據(jù)普通草魚TPM基因cDNA全長設計了熒光定量引物TPM-F和TPM-R, 以β-actin為內(nèi)參基因, 使用熒光定量PCR檢測了TPM基因在普通草魚和脆肉鯇不同組織中的表達情況。結果顯示, TPM基因在所檢測的普通草魚和脆肉鯇7個組織中均有表達, TPM基因在普通草魚腹肌表達最高和其次為前腸中表達。TPM基因在脆肉鯇腹肌中的表達低于普通草魚。而脆肉鯇中肌肉、肝臟、腎臟、前腸、后腸中TPM表達量大于普通草魚肌肉、肝臟、腎臟、前腸、后腸組織, 且差異顯著(< 0.05)(圖3)。

圖3 不同組織TPM mRNA相對表達豐度(平均值±標準差, n = 3), 字母不同表示有顯著性差異(P < 0.05)。

3 討論

Tropomyosin是一類分布廣泛、進化保守的蛋白, 在肌肉形成和收縮過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用, 目前在人、斑馬魚、鱘魚、七鰓鰻、大麻哈魚、金槍魚、白姑魚、斑點石斑魚、鱈魚等生物中有報道[13-17]。研究顯示分子量為32～40 ku的原肌球蛋白基因為多數(shù)甲殼類及軟體動物的主要過敏源。目前主要把原肌球蛋白當做一種過敏原來研究[18-26], 到目前為止草魚的原肌球蛋白還沒見報道。對于其在草魚中是否有免疫作用還需進一步研究。本研究中草魚肌肉轉錄組數(shù)據(jù)測得的草魚TPM cDNA長度為1 705 bp, 包含387 bp 的5’UTR 序列, 1 307 bp的3’UTR 序列, 855 bp開放閱讀框, 編碼284個氨基酸。對草魚TPM的氨基酸序列進行三級結構同源建模, 該模型中總共包括277個α螺旋, 7個無規(guī)則卷曲, 目標蛋白序列與參考模板序列比對同源性為80.57%, 可推斷該蛋白結構較穩(wěn)固, 其蛋白熱穩(wěn)定性高。國內(nèi)外的報道表明, TPM蛋白序列有高度的保守性, 是包括甲殼類在內(nèi)的無脊椎動物的主要過敏原, 由于TPM是肌原纖維結構蛋白越來越多的報道表明, 基于轉錄組數(shù)據(jù)庫及RACE技術, 首次在草魚體內(nèi)克隆到草魚TPM基因cDNA。生物信息學分析表明, 草魚TPM與斑馬魚、墨西哥脂鯉的草魚TPM核苷酸同源性分別是93％和87％, 氨基酸同源性分別是96％和93％。草魚TPM與鯉魚和鳙魚的氨基酸同源性分別是92％和98％。在聚類上也是草魚TPM基因與斑馬魚TPM基因聚類在一起后, 再與墨西哥脂鯉TPM基因聚類, 反映了在一同比較和聚類的魚類中, 草魚、斑馬魚和墨西哥脂鯉的親緣關系近, 這都與3種魚在分類地位同屬鯉形目一致的關系, 也同樣印證了本試驗的聚類、與核苷酸同源性及與氨基酸同源性分析的正確性。

TPM基因調(diào)控骨骼肌細肌絲活動及免疫方面的重要作用和功能。原肌球蛋白作為一種重要的蛋白成分幾乎存在于所有的動物組織中。TPM基因在所有試驗的7個組織中均有較高的表達。TPM基因在普通草魚腹肌表達最高, 其次為在前腸中表達。TPM基因在脆肉鯇中腹肌中的表達低于普通草魚。而脆肉鯇中肌肉、肝臟、腎臟、前腸、后腸中TPM表達量大于其在普通草魚同類組織中的表達, 且差異顯著(< 0.05)。肌肉衛(wèi)星細胞的增值分化能夠改變肌纖維數(shù)量和肌纖維的類型, 衛(wèi)星細胞的多潛能性使其轉變?yōu)橹炯毎麖亩黾蛹?nèi)脂肪的含量, 而衛(wèi)星細胞的增值分化對增加動物產(chǎn)量, 改良動物肉品質(zhì)也有重要影響[27-29], 考慮到原肌球蛋白與肌肉收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì), 也是真核細胞細肌絲中不可缺少的組成成分, 其與肌肉的生長和運動息息相關, 推測TPM4a基因也可能在草魚肌肉衛(wèi)星細胞增殖分化中發(fā)揮作用, 因此, 對其開展深入研究對探明草魚脆化機理具有很重要的意義。

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(責任編校:劉曉霞)

Molecular cloning and expression analysis of tropomyosin gene from

Sun Nian1, Chen Kaijian1, Chu Wuying2, Xiao Tiaoyi1, Li Di1

(1. Institute of Animal Science, Hunan Agricultural University, Changsha 410003, China; 2. BiologicalEngineering and Environmental Science Department,Changsha University, Changsha 410003, China)

To reveal the original role of TPM gene inmuscle, using rapid amplification of cDNA ends (RACE), the full length of TPM cDNA sequence inis cloned, and the expression of different tissues in commonand embrittlement ofare analyzed by Real-time PCR. The sequence analysis shows that the TPM cDNA had 1 705 bp in length with a 3′-untranslated region (1 307 bp), a 5′-untranslated region (387 bp), and a 855 bp open reading frame (ORF). Bioinformatics analysis predicts that the ORF of TPM4a cDNA encoded a protein of 284 amino acid residuals with a structure of protein tertiary model with 277 alpha helix and 7 random curl. The phylogenetic analysis shows that the amino acid sequence of commonTPM possessed 96% and 93% identity with the TPMs ofand, respectively. Real-time PCR results demonstrated that the abdominal muscle of commonhad the highest expression of TPM, and next the foregut. Comparing with embrittlement of, TPM shows lower expression inabdominal muscle of common, while the higher expression of embrittlement of grass carp tissues were muscle, liver, spleen, foregut and hindgut. The results indicate that TPM can be a new candidate target gene for investigating embrittlement mechanism ofembrittlement and improving healthy level of culture.

common; TPM; gene expression; embrittlement of

10.3969/j.issn.1672–6146.2015.02.016

TS 254.1

1672–6146(2015)02–0051–06

肖調(diào)義, tyxiao1128@163.com; 孫念, snty9326@163.com; 陳開健, chenkaijian2002@yahoo.com.cn。

2014-12-26