酶聯(lián)免疫法測定飼料中鹽酸克倫特羅

邢 磊，王仁華

(1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，南昌 330029；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)

酶聯(lián)免疫法測定飼料中鹽酸克倫特羅

邢 磊1，王仁華2*

(1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，南昌 330029；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)

當(dāng)前關(guān)于檢測飼料中鹽酸克倫特羅的方法主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）。本試驗(yàn)的目的是為了檢驗(yàn)酶聯(lián)免疫法（ELISA）對飼料中鹽酸克侖特羅檢測的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)結(jié)果表明：酶聯(lián)免疫法回收率為86.48%～95.54%，測得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的R為0.994，酶聯(lián)免疫法具有操作簡便、分析速度快、靈敏度高、成本低，適合大批量樣品的快速篩選。

鹽酸克倫特羅；酶聯(lián)免疫法；飼料

鹽酸克倫特羅(clenbuterol，簡稱CLB)是一種β-類的腎上腺類神經(jīng)興奮劑，添加于飼料中能有效地促進(jìn)動(dòng)物體蛋白質(zhì)沉積、促進(jìn)脂肪分解抑制脂肪沉積，有明顯的促生長和提高瘦肉率的作用，但如果在飼料中超量使用，使得人食用CLB殘留畜產(chǎn)品后對人體具有很強(qiáng)的毒副作用，因此，鹽酸克倫特羅的準(zhǔn)確測定顯得極為重要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

ELISA試劑盒、離心機(jī)、微量震蕩器、酶標(biāo)分析儀、移液槍、分析天平等。

1.2 方法

1.2.1 樣品的準(zhǔn)備

對于固相樣品的前處理，分別稱取飼料0.5 g，放入4只離心管中并編號(hào)1、2、3、4號(hào)，在2、3、4號(hào)管中分別加入0.4、0.2、0.1 mL的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為100 ng/mL）；再往4個(gè)離心管里分別加入0.01M鹽酸溶液5 mL，充分混勻放在微量振蕩器上振蕩，并用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)到pH到7.5±0.5，在每分鐘5 000 轉(zhuǎn)離心機(jī)中離心5 min。取出200μL上清液加入已經(jīng)按照1：10的比例稀釋好的800μL樣品稀釋工作液，振蕩均勻（放在微量振蕩），靜置。取50μL用于檢測。

1.2.2 檢測過程

確認(rèn)樣品已完成前處理，試劑盒中的試劑以及酶標(biāo)板都已回溫充分，從微板上取下所需數(shù)量的微孔（將多余的微孔重新封存），在微孔板上進(jìn)行編號(hào)，標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品A1 2-F1 2和樣品的位置，進(jìn)行雙孔平行實(shí)驗(yàn)。在標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50 uL鹽酸克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)液，濃度 分 別是：0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ng/mL，取50 μL飼料樣品溶液注入各樣品孔中；用新的吸頭配合8道移液槍和加樣槽使用，立即在所有孔中加入100 μL的酶標(biāo)物工作液，注意要正確操作確保將吸頭中的液體排空，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘，在22～25 ℃ 條件下孵育30 min（孵育過程中要不時(shí)輕拍震蕩酶標(biāo)板，可減少雙孔誤差，提高檢測準(zhǔn)確性）；倒掉微孔中的液體，在微孔中加入用去離子水按1：20（1+19）稀釋好的清洗液250 μL，輕輕敲動(dòng)反應(yīng)板，然后倒掉微孔中的液體，重復(fù)上一步驟，3遍，總共洗板4次，然后將反應(yīng)板倒扣在吸水紙上拍干，用吸耳球徹底清除掉微孔中的殘留液和氣泡，清洗程序完成后（立即進(jìn)行下一步驟，切勿讓微孔干燥）。用8道移液槍和加樣槽配合使用立即向每個(gè)微孔中加入100 μL顯色劑，晃動(dòng)反應(yīng)板使之混勻，在22～25 ℃條件下顯色10 min，用8道移液槍和加樣槽配合使用，加100 μL的終止液于每個(gè)微孔中，微孔中的顏色由藍(lán)色變成黃色，將酶標(biāo)儀調(diào)至450 nm檢測吸光度，結(jié)果要在10 min內(nèi)讀取才有效。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將沒有用完的試劑裝回試劑盒封存于2～8 ℃的冰箱中。

2 結(jié)果與計(jì)算

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

酶標(biāo)儀讀數(shù)的結(jié)果見表1。

表1 酶標(biāo)儀讀數(shù)

2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過測得的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值來繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果均由Romer Log/Logit軟件計(jì)算得出。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1。

2.3 樣品及回收率測定結(jié)果

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的飼料樣品中鹽酸克倫特羅含量及陽性添加回收率見表3。

在回收率測定試驗(yàn)中，空白對照組檢測出鹽酸克倫特羅的含量為0.03 ng/ mL低于檢測限表明未檢出。該豆粕樣品的成分較復(fù)雜，可能含有與鹽酸克倫特羅結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)成分，引起交叉反應(yīng)，致使結(jié)果出現(xiàn)偏差。在計(jì)算回收率時(shí)把差值去除即可，測定的回收率在86.48%～95.54%之間。本實(shí)驗(yàn)中飼料樣品檢測限為10 μg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本次實(shí)驗(yàn)檢測的誤差較小，所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

圖1 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，若板孔顯示的顏色較淡，原因可能有：試劑盒超過有效期，移液器計(jì)量不夠準(zhǔn)確，洗板及加樣過程中，酶標(biāo)受污染，影響催化劑顯色劑顯色的能力，洗板次數(shù)過多，洗滌沖擊力太大。若重復(fù)性不好，原因可能是：樣品加入后未混勻，洗滌不正確，移液器加酶或顯色劑不均。ELISA實(shí)驗(yàn)靈敏度較高，因此操作中的各個(gè)步驟對實(shí)驗(yàn)的檢測效果影響較大，稍不注意，就有可能影響測試結(jié)果。因此，實(shí)驗(yàn)過程必須嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用試劑盒前必須仔細(xì)閱讀說明書，嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作，終止液、顯色劑有刺激性，請勿接觸皮膚，試劑盒在不使用時(shí)，需放置在2～8 ℃干燥保存，不能置于0 ℃以下的冰箱中保存，并確保在有效期之前使用。在使用前，所有試劑及試劑盒內(nèi)的材料必須室溫22～25 ℃回溫1 h以上，一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度與操作是否規(guī)范合理有很大的關(guān)系，因此在實(shí)驗(yàn)操作過程中必須嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，不要改變分析步驟和中斷任何程序，規(guī)范使用移液槍不可有氣泡，加樣時(shí)不能加到孔璧上，每次加樣移取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，都要更換吸頭，避免交叉吸取污染標(biāo)準(zhǔn)品，試劑盒使用過程中無需使用蓋板膜，無需避光反應(yīng)，應(yīng)保證樣品萃取液的pH在6.75±0.25。pH過高或過低均會(huì)影響檢測結(jié)果，不能將任何未使用的或用剩的試劑倒回原裝瓶中，檢驗(yàn)過程中應(yīng)分清樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的位置，在檢驗(yàn)的整個(gè)過程中，任何時(shí)候都禁止搖動(dòng)微孔板以防止微孔內(nèi)的液體混合。實(shí)驗(yàn)中加樣過程要快，盡量使前后孔的溫育時(shí)間保持一致。溫育時(shí)間要控制準(zhǔn)確。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)完成讀數(shù)，否則將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)用ELISA法檢測飼料中的鹽酸克倫特羅含量，該方法特異性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好、快速簡便，并可同時(shí)對多份樣品進(jìn)行快速檢測，有較好的應(yīng)用前景。ELISA因其檢測試劑盒檢測數(shù)量大（一般為96孔板），通常用作大規(guī)模樣品篩選是目前較常用的檢測手段。由測得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的R為0.994，測定的回收率在86.48%～95.54%之間。以此數(shù)據(jù)表明本次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性較高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。酶聯(lián)免疫法為飼料產(chǎn)品以及畜產(chǎn)品的安全提供了保障，此方法值得推廣。

2015-07-10)

王仁華，高級實(shí)驗(yàn)師。