李翠+侯蕾+任麗+張燁+鄭奕雄+王興軍

摘要：熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）和熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock factors.HSFs）在植物熱脅迫信號轉(zhuǎn)導和耐熱性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要作用。本研究從花生轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選到HSP70、HSF的eDNA片段，通過序列比對在花生全基因組序列中獲得這兩個基因的基因組序列，根據(jù)序列信息設(shè)計引物，以花生葉片eDNA為模板擴增全長ORF并進行生物信息學分析結(jié)果顯示，AhHSP70基因的ORF全為1 962 bp，編碼653個氨基酸，分子質(zhì)量為72.45 kD，理論等電點pl為4.93；AhHSF基因的ORF全長為1 212 bp，編碼403個氨基酸，分子質(zhì)量為46.03 kD，理論等電點pl為4.85。AhHSP70與AhHSF均不具有信號肽，為可溶性蛋白，二級結(jié)構(gòu)中有大量無規(guī)則卷曲。利用這兩個基因的氨基酸序列分別與來源于其他物種HSP70、HSF的氨基酸序列進行同源比對，并構(gòu)建進化樹進行親緣關(guān)系分析，結(jié)果表明，AhHSP70與大豆GmHSP70親緣關(guān)系較近，與番茄SlHSP70親緣關(guān)系比較遠；AhHSF與菜豆PaHSF親緣關(guān)系較近，而與蒺藜苜蓿MtHSF的親緣關(guān)系較遠。利用實時熒光定量PCR對AhHSP70和AhHSF在熱脅迫情況下的表達進行分析，結(jié)果表明這兩個基因在42℃高溫條件下表達量顯著升高，AhHSP70在高溫脅迫3 h后表達明顯升高，熱處理24 h和48 h后，表達量為對照的 50倍和135倍；轉(zhuǎn)錄因子AhHSP在高溫脅迫3 h后表達明顯升高，高溫處理6 h后達到最高，隨后下降。本研究初步驗證了花生熱激蛋白和熱激因子基因在花生響應(yīng)高溫脅迫中的作用。

關(guān)鍵詞：花生；熱激蛋白；熱激因子；基因克?。恍蛄蟹治?；基因表達

中圖分類號：S565.203.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）04-0001-07

收稿日期：2015-01-30

基金項目：國家自然科學基金項目（21376281）；國家“863”計劃項目（2013AA102602）；山東省生物資源創(chuàng)新項目；濟南市科技創(chuàng)新項目（20l102033）；山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專項（2012ZHZXIA0418）

熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一類進化保守的多肽，在機體受到高低溫、干旱、鹽漬、缺氧、機械損傷等多種環(huán)境脅迫時誘導合成[1]，其中高溫足誘導HSPs合成的主要因素[2]，故又稱應(yīng)激蛋白或熱休克蛋白。HSPs作為一種分子伴侶，能夠及時將受熱損傷的蛋白聚集，協(xié)助其肽鏈的折疊，促使其復性從而恢復體內(nèi)正常蛋白的功能[3]。張建國等[4]研究發(fā)現(xiàn)，HSPs的積累水平與生物的耐熱性呈顯著正相關(guān)。熱激因子（heat shock factors，HSFs）是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)熱激應(yīng)答的一類轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于細胞核內(nèi)，能激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，在植物熱脅迫信號轉(zhuǎn)導和耐熱性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要的作用[5]。

HSPs作為一類逆境脅迫蛋白，可以被多種逆境所誘導，并能夠減輕脅迫引起的傷害，Lurie等[6]還發(fā)現(xiàn)HSPs蛋白具有交叉保護的功能。Tissieres等[7]首次在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白HSPs，隨后發(fā)現(xiàn)動物、植物、微生物都能合成HSPs。在生物體內(nèi)熱激蛋白有多種形式，例如泛索（ubiquitin）是一類組成型表達的熱激蛋白，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulphide - isomerase，PID））也被認為是一種熱激蛋白[8]。根據(jù)分子量大小的不同，可將HSPs分為5個家族，即HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP[9]。其中HSP90具有調(diào)節(jié)作用，可作用于激素受體，保證受體呈無活性狀態(tài)[10]。HSP70是HSPs家族中最為保守也是最重要的一類蛋白[11]，是目前研究最深入的一類蛋白，在依賴ATP的蛋白質(zhì)折疊和裝配中起作用。HSP70結(jié)構(gòu)包括N端ATPase結(jié)合區(qū)以及C端多肽結(jié)合區(qū)，N端序列高度保守，具有結(jié)合并水解ATP的活性[12，13]。HSP60最早被稱為分子伴侶，線粒體HSP60主要參與了核編碼的線粒體蛋白質(zhì)的加工、定位和裝配，小分子HSP在熱激及其恢復時，在細胞質(zhì)、細胞核以及細胞器之間運動，保護細胞免受高溫傷害，修補被損傷的蛋白。小分子熱激蛋白N端序列在不同物種中差異較大，C端則高度保守[14]。植物熱激蛋白可以在不同的器官中被誘導，可在根、莖、葉、種子以及幼苗中產(chǎn)生，也可在體外單個細胞中產(chǎn)生，此外，它們也可定位于不同的細胞器中。

典型的熱激轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)包括N端的DNA結(jié)合域（DBD）、寡聚化結(jié)構(gòu)域（OD）、核定位信號（NLS）、核輸出信號（NES）和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。植物熱激轉(zhuǎn)錄因子可通過形成回文發(fā)卡結(jié)構(gòu)，特異結(jié)合熱激蛋白基因啟動子中高度保守的熱激元件，控制熱激蛋白基因的表達[4]。如熱脅迫條件下，擬南芥中的HSF可調(diào)節(jié)HSP110、HSP70和小分子HSP的表達[15]。根據(jù)表達特性不同，熱激轉(zhuǎn)錄因子可分為組成型和誘導型兩種，一般參與脅迫應(yīng)答的主要是誘導型熱激轉(zhuǎn)錄因子。最早的熱激轉(zhuǎn)錄因子是在酵母中被克隆得到的，隨后在果蠅和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)并克隆[17]。在植物中，道德是在番茄中克隆[18]，目前在擬南芥、水稻、玉米、大豆等植物中均開始了對該基因家族的研究[16，19，20]。

本試驗從花生葉片中克隆了AhHSP70和AhHSF的全長編碼序列，分別對其進行生物信息學分析，并利用實時定量PCR技術(shù)在mRNA水平檢測了高溫脅迫對花生AhHSP70和AhHSF表達的影響，了解熱激蛋白在花生抗逆脅迫中的作用，為探討花生響應(yīng)高溫的分子機理、選育耐高溫的花生新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為花生耐旱品種仲愷花1號，由仲愷農(nóng)業(yè)工程學院種子科學與工程研究所提供。大腸桿菌（Escherichia coli）菌種DH5α為山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心保存。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶、Tap DNA聚合酶購自Fermentas公司；pMD18-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA酶、實時熒光定量PCR試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）購自羅氏試劑公司，LA Taq DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司。PCR引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。endprint

1.2 試驗方法

1.2.1 42℃高溫處理 將仲愷花1號在溫室中培養(yǎng)，待其幼苗長出2周左右，選取18株長勢基本一致的花生幼苗，每3株作為一個重復，進行42℃持續(xù)高溫處理，分別于處理0、3、6、12、24、48 h對葉片進行取樣，迅速置于液氮并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取與eDNA的合成 高溫處理不同時間的花生葉片總RNA的提取采用CTAB-LiCl法，用CTAB提取液裂解研磨好的植物組織，氯仿/飽和酚抽提，去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，LiCl、無水乙醇沉淀RNA，隨后進行DNA消化，獲得總RNA。用紫外可見分光光度計測定RNA的濃度，上樣2 μg瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RNA，在Alpha Imager PE型凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand eDNA Synthesis Kit）說明進行反轉(zhuǎn)錄獲得eDNA。

1.2.3 AhHSP70和AhHSF基因eDNA全長序列的克隆 從花生轉(zhuǎn)錄組序列中篩選到HSP70和HSF基因的eDNA片段，通過同源查找花生全基因組序列（未發(fā)表數(shù)據(jù)）獲得兩個基因的基因組序列，根據(jù)基因組序列中預測的編碼區(qū)設(shè)計引物，以花生葉片eDNA為模板克隆兩個基因的ORF全長，分別命名為AhHSP70和AhHSF。

PCR擴增基因全長的反應(yīng)體系（50 μl）：1 μL的eDNA模板，5 U/μL Pfu高保真DNA聚合酶0.5 μL，5×Buffer 5 μl，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，正反向引物各2 μL以及ddH2O 35.5μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，保存溫度為4℃。

反應(yīng)結(jié)束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段回收純化后平末端加A，加A產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，后經(jīng)菌液PCR檢測，挑取含有目的片段的菌液在山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)中心測序中心進行測序，得到HSP70和HSF的ORF序列。所使用的引物序列見表1。

1.2.4 AhHSP70和AhHSF序列的生物信息學分析 利用DNAStar軟件將測得的序列翻譯成氨基酸序列，用DNAMAN軟件分析其氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)、親水性/疏水性以及跨膜結(jié)構(gòu)；用MEGA5.0軟件分別對其氨基酸構(gòu)建進化樹，進行進化分析；在線軟件Protparatam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）分析其理化性質(zhì)；在線工具PSORT（http：//psort.nibb.ae.jp/form.html）預測其亞細胞定位；Signal P 3.0在線軟件預測其信號肽；SMART和InterPro在線軟件對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進行分析預測.

1.2.5 AhHSP70和AhHSF基因的表達分析 利用qRT-PCR分析花生經(jīng)過高溫處理O、3、6、l2、24、48 h后基因的表達。以組成型表達的花生Actin基因作為內(nèi)參，實時定量PCR引物為AhHSP70realF、AhHSP70realR和AhHSFrealF、AhHSFrealR（表1）。采用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）按說明書進行操作。用ABI PRISM 7900HT實時定量PCR儀進行反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95℃預變性10 s；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)；溶解曲線分析：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s。重復試驗3次。根據(jù)溶解曲線檢測PCR產(chǎn)物的特異性?；虮磉_差異通過2-△△CT方法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhHSP70和AhHSF基因克隆及進化樹分析

以花生葉片eDNA為模板擴增AhHSP70和AhHSF開放讀碼框，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。由圖可見，擴增條帶的長度分別為2 000 bp和1 500 bp左右。同收目的片段末端加A后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，選取陽性菌落進行測序，經(jīng)正反向拼接，AhHSP70基因的全長ORF為1 962 bp，編碼含653個氨基酸的肽鏈；AhHSF基因的全長ORF為1 212 bp，編碼含403個氨基酸的肽鏈。

從GenBank獲得大豆、水稻、豌豆等植物的熱激蛋白HSP70和HSF序列，利用DNAMAN軟件分別對不同植物來源的HSP70和HSF進行同源性分析，并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建進化樹（圖2a、b）。結(jié)果表明，AhHSP70與大豆和豌豆的HSP70親緣關(guān)系較近，處于同—分支，而與小麥、棉花、番茄等的HSP70親緣關(guān)系較遠；AhHSF與菜豆和紫苜蓿的HSF親緣關(guān)系比較近，而與蒺藜苜蓿和大豆等的HSF親緣關(guān)系較遠

2.2 AhHSP70和AhHSF蛋白的理化性質(zhì)、細胞定位分析

使用Protparatam在線工具分析AhHSP70和AhHSF蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示AhHSP70蛋白的分子質(zhì)量為71.45 kD，理論等電點pI為4.93。在氨基酸構(gòu)成中，相對含量較多的是Ala、Glu、Gly和Lys，分別占9.2%、8.6%、8.90%和8.3%?？偟膸ж撾姾傻臍埢ˋsp+Glu）有102個，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）有86個。AhHSF分子質(zhì)量為46.03 kD，理論等電點pI為4.85。在氨基酸構(gòu)成中，含量較多的是Ser、Glu、Leu和Asp，分別占12.2%、9.7%、7.7%和6.7%?？偟膸ж撾姾傻臍埢ˋsp+Glu）有66個，帶正電倚的殘基（Arg+Lys）有40個。

通過DNAMAN軟件分別對AhHSP70、AhHSF兩個蛋白序列疏水性/親水性以及它們的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測和分析，結(jié)果表明，AhHSP70與AhHSF肽鏈中親水氨基酸分布都比較均勻，并且數(shù)量大于疏水氨基酸（圖3），且兩者均不含跨膜結(jié)構(gòu)域?？梢酝茢郃hHSP70和AhHSF均為可溶性蛋白。endprint

亞細胞定位預測結(jié)果顯示，AhHSP70和AhHSF蛋白在細胞核定位的概率均可達0.76，因此，推測AhHSP70和AhHSF定位于細胞核的可能性比較大。運用Signal P 3.0在線軟件對AhHSP70和AhHSF蛋白序列信號肽進行預測分析，結(jié)果顯示這兩個蛋白均無信號肽。

2.3 AhHSP70和AhHSF二級結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域的預測及分析

用DNAMAN軟件對花生AhHSP70和AhHSF蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)進行預測 結(jié)果顯示，AhHSP70和AhHSF蛋白序列中，均有α-螺旋、無則卷曲、β-折疊三種二級結(jié)構(gòu)，其中無規(guī)則卷曲是AhHSP70和AhHSF蛋白中最大量的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋和β-折疊分布于整個蛋白質(zhì)分子中。通過SMART和InterPro工具在線軟件預測分析表明，AhHSP70蛋白C端391～548 aa處為底物結(jié)合位點區(qū)域.637～646 aa處是一段低復雜性區(qū)段（Lowe-complexity region，LCR）。AhHSF蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，N端10～103 aa處具有典型的DBD結(jié)構(gòu)域，內(nèi)部存在一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的疏水結(jié)構(gòu)，該疏水結(jié)構(gòu)可以精確定位并識別啟動子區(qū)熱激元件（HSE），在HSP基因轉(zhuǎn)錄時DBD區(qū)域可與HSE結(jié)合，從而調(diào)控熱激蛋白基因的表達[21]。C端有一段保守的的卷曲螺旋區(qū)域（coiled coil region）以及LCR。

2.4 AhHSP70和AhHSF基因的表達分析

實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，花生在42℃高溫脅迫條件下，AhHSP70和AhHSF兩個基因表達量均顯著增加。基中AhHSP70高溫處理3 h時表達量開始升高，24 h時表達量大幅度升高，48 h后仍繼續(xù)升高，表達量達到處理前的135倍，說明AhHSP70在高溫脅迫下表達顯著升高，響應(yīng)熱脅迫長時間誘導。AhHSF在高溫脅迫3 h表達顯著升高，在高溫脅迫6 h表達量達到最高，為處理前的624倍，隨后下降，但到48 h表達量仍高達處理前的23倍（圖4）。

3 討論

植物在生長發(fā)育過程中會受到各種逆境脅迫的影響，體內(nèi)會產(chǎn)生一系列復雜的防御機制來進行自我保護，如在高溫等脅迫條件下，生物體內(nèi)熱激蛋白合成發(fā)生變化，降低生物體在脅迫中受到的傷害，是一種有效的防御措施。目前已有很多植物的熱激蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子基因被克隆，并研究了它們在植物抵御逆境脅迫中的作用。

本研究利用花生轉(zhuǎn)錄組和全基因組序列結(jié)果，從花生葉片中克隆獲得AhHSP70和AhHSF的完整ORF，通過氨基酸序列同源性比對分析表明，AhHSP70與豆科植物大豆GmHSP70親緣關(guān)系較近，AhHSF與豆科植物菜豆PaHSF序列相似性較高。亞細胞定位分析顯示高溫處理情況下AhHSP70和AhHSF主要定位于細胞核中，推測熱激蛋白AjHSP70可能參與核內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、折疊及解折疊的作用，而熱脅迫條件下熱激轉(zhuǎn)錄因子AhHSF進入細胞核從而調(diào)控下游基因表達對AhHSP70和AhHSF蛋白結(jié)構(gòu)域的預測分析表明，AhHSP70 C端具有底物結(jié)合位點，可能參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運、跨膜運輸以及蛋白質(zhì)降解調(diào)控等過程，與行使分子伴侶的功能有關(guān)；AhHSF蛋白結(jié)構(gòu)的N端具有DNA結(jié)合區(qū)域，與調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

HSPs作為一種分子伴侶型的應(yīng)激蛋白，能夠?qū)ν饨绛h(huán)境刺激做出應(yīng)答反應(yīng)，減少高溫對生物體的傷害，有效地提高生物體對惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力[22，23]。此外，HSPs能夠提高細胞的應(yīng)激能力，具有保護細胞或機體免受損傷的作用。近年來的研究表明，除高溫之外，其他環(huán)境脅迫如干旱、低溫等也會誘導HSPs的產(chǎn)生。另外，正常情況下生物體內(nèi)也會有HSPs的存在。本研究利用qRT-PCR對AhHSP70和AhHSF基因的表達分析顯示，在受到42℃熱脅迫條件下花生葉片中AhHSP70在3 h表達量開始升高，24 h以后表達量持續(xù)大幅度升高。大豆中的研究結(jié)果顯示，熱處理3～5 min就可以檢測到大豆幼苗中熱激蛋白mRNA的積累，l～2 h達到高峰，6 h后mRNA水平顯著下降，12 h表達量幾乎為零[24]。擬南芥中對HSP70家族多個基因表達分析的結(jié)果顯示，除了mtHsc70-1（屬于擬南芥中線粒體HSP70家族）和cpHsc70-1（屬于擬南芥中葉綠體HSP70家族）兩個基因，其他基因在40℃熱處理后表達上調(diào)，多數(shù)基因在處理30 min表達量就上升到最大，之后緩慢下降，如HSP70-2基因，少數(shù)基因在60 min時表達量最高，之后下降，如HSP70基因[25]。玉米中也有類似的情況.熱激蛋白的誘導合成只持續(xù)4 h，隨后下降。而本試驗中，AhHSP70在高溫處理48 h仍持續(xù)高表達，且受誘導時間周期延長。因此，熱激蛋白在不同植物體內(nèi)的表達模式有所差異，花生中AhHSP70可能在持續(xù)高溫下對調(diào)控植物的生長起到重要作用。對熱激因子的表達在植物中也有研究，其響應(yīng)熱激脅迫的周期普遍較短。陳先知等[26]發(fā)現(xiàn)對一黃瓜進行2 h熱處理后，全基因組中的熱激轉(zhuǎn)錄因子表達水平存在很大差異，大部分轉(zhuǎn)錄因子表達量顯著上升。擬南芥中AtHsfA2在正常條件下基本檢測不到表達，37℃熱處理0.5 h到1 h表達量最高，隨后明顯降低，處理12 h表達量降低為零[6]。本試驗中，AhHSF在高溫脅迫3 h時表達量顯著升高，到6 h時達到最高，隨后表達量顯著下降，可能是由于在高溫初期，AhHSF的表達上調(diào)激活下游相關(guān)熱激蛋白的表達，隨著熱處理時間延長，熱激蛋白的高表達可能會對其表達具有抑制作用，因此，表達量有所下降.這與宮本賀等[27]在麝香百合中的研究結(jié)果相似，但麝香百合熱激轉(zhuǎn)錄因子表達量下降后又出現(xiàn)上升趨勢，可以看出AhHSF在不同植物中表達模式也是有差異的根據(jù)以上結(jié)果推測AhHSF在花生感受高溫脅迫的初期行使調(diào)控作用，表明AhHSF是一個受高溫誘導且在高溫環(huán)境中起調(diào)節(jié)作用的熱激轉(zhuǎn)錄因子。

4 結(jié)論

本研究克隆到花生熱激蛋白AhHSP70和熱激因子AhHSF的基因全長ORF，通過實時熒光定量PCR分析高溫處理不同時間AhHSP70與AhHSF的表達，結(jié)果顯示，AhHSP70對熱刺激初期不敏感，長時間高溫誘導后上調(diào)劇烈；在高溫條件下AhHSF表達水平快速上調(diào)，隨后快速下調(diào)。該結(jié)果為進一步研究熱激蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的基因功能奠定了基礎(chǔ)，為闡明其在花生適應(yīng)逆境脅迫的作用機理具有重要作用。endprint