楊莉　歐都　齊亞銀　張莉

摘要：為了研究寒冷應激對阿勒泰羊脂肪酸合成酶 mRNA表達的影響，在寒冷應激前后分別采集湖羊及阿勒泰羊各個部位的組織，采用RT-PCR方法檢測各組織中肪肪酸合成酶（Fas） mRNA表達水平，分析在不同品種、不同部位寒冷應激后其表達的變化。結果顯示，阿勒泰羊及湖羊Fas mRNA表達量在應激后均有下降，阿勒泰羊尤為顯著，且應激后尾部和頸部冷表達量最低。研究表明，在寒冷應激下脂肪酸合成減少，脂肪作為能源物質被分解供能并維持體溫的恒定，以適應冷刺激。

關鍵詞：寒冷應激；脂肪酸合成酶；阿勒泰羊；湖羊；mRNA表達水平

中圖分類號： S826.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0028-03

應激于1936年由加拿大病理生理學家 Selye首次提出，并定義為機體對外界或內部的各種異常刺激所產(chǎn)生的非特異性應答反應的總和。對動物而言，環(huán)境的冷熱、創(chuàng)傷、驚嚇都屬于應激刺激。不同的應激源產(chǎn)生的神經(jīng)內分泌系統(tǒng)的調節(jié)機制和機體所產(chǎn)生的生物學效應不同。而冷應激是高寒地區(qū)最普遍的應激源之一，新疆阿勒泰地區(qū)位于中國西北邊陲，冬季長達半年，溫度最低可達-40 ℃，四季不分明，只有冷暖差別。許多優(yōu)良綿羊品種無法適應阿勒泰地區(qū)異常寒冷的氣候條件，而阿勒泰羊以其抗寒性強、耐粗飼等特點，成為當?shù)氐膬?yōu)良類群[1]。

肪肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)as）是脂肪合成的關鍵酶之一，它參與長鏈脂肪酸合成的一系列反應，最后生成棕擱酸。動物機體中脂肪合成和沉積所需的脂肪酸大部分都來源于脂肪酸的從頭合成，即乙酰輔酶A（CoA）和丙二酸單酰CoA在Fas的催化下合成脂肪酸的過程，進而脂肪酸與甘油合成甘油三脂，F(xiàn)as在機體組織中的表達量和酶的活性對脂肪酸的合成和脂肪的沉積具有決定性作用[2-3]。

新疆阿勒泰羊全身肌肉豐滿肥碩，尾根附近沉積大量脂肪，能夠適應阿勒泰地區(qū)異常寒冷的氣候條件。筆者所在實驗室前期的研究證實，阿勒泰羊的脂肪酸代謝對體溫降低的適應很敏感，為了研究其脂肪組織在抗寒中的重要性，確定其在寒冷的環(huán)境下是否作為主要的能源物質參與產(chǎn)熱以維持溫度的恒定，本試驗采用實時熒光定量方法檢測寒冷應激前后阿勒泰羊和湖羊各部位脂肪組織Fas mRNA 的表達量，旨在從低溫對不同品種綿羊脂肪組織的合成方面分析阿勒泰羊耐寒的可能適應機制，為新疆綿羊抗寒育種工作提供理論依據(jù)，減少寒冷應激對養(yǎng)羊業(yè)帶來的損失。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

選擇新疆福?？h健康成年的阿勒泰羊和湖羊各5只，在寒冷應激前（10月）和寒冷應激后（1月）分別采集湖羊及阿勒泰羊頸部肌間脂肪、胸部肌間脂肪、腹部肌間脂肪、腿部肌間脂肪、尾部脂肪以及肝臟等6個部位的組織，立即放入液氮罐速凍，轉入-80 ℃冰箱中進行保存。

Trizol、DEPC、DNA Marker、mix、質粒提取試劑盒（批號：DP103-02）購自天根生物科技服務有限公司；PrimeScriptRT reagent kit反轉試劑盒（批號：RR047A）、pMD18-T Simple Vector、SYBR Premix Ex TaqTM kit試劑盒購自TaKaRa公司（批號：DRR420A）；DNA凝膠回收試劑盒（批號：DP209-02）；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、瓊脂糖、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購自北京華美生物工程公司；感受態(tài)細胞大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α為筆者所在實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的綿羊Fas基因為模版（登錄號：AF479289.1）用 Primer Premier 5.0軟件設計引物，由北京六合華大基因有限公司合成。上游引物：5′-CCTCGGTGCCCGTTGTCTAC-3′；下游引物：5′-TGCTGCTCAAAGGATGTGTC-3′，目的片段長度為256 bp。

1.2.2 RNA的提取 利用TRIZOL一步法提取試驗樣品的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量，-70 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ缓笠来渭尤胍韵略噭篟NA 1 μg，10× Reaction buffer 2 μL，MgCl2 1 μL，DNase Ⅰ-RNase-free 1 μL，DEPC處理水補足10 μL，除去存在的少量基因組 DNA。37 ℃反應 30 min，然后加入1 μL 50 mol/L EDTA，65 ℃ 孵化10 min，即可用此RNA作為反轉錄的模板。以RNase-free水為對照，用紫外分光光度計測定D260 nm/D280 nm的值和總RNA濃度。

1.2.3 反轉錄 向提取純化好的各組織總RNA中加入以下試劑：5× gDNA Eraser bufferⅠ2 μL，5× gDNA EraserⅠ1 μL，總RNA 1 μL，無核酸酶水補足至10 μL。42 ℃孵育混合物3 min，冷卻后，向下旋轉混勻，將管子放回冰上。再向以上反應液中按指定順序加入如下試劑：無核酸酶水Ⅰ4 μL，5×prime sclipt buffer 2 4 μL，RT Prime MixⅠ1 μL，prime Script RT Enzyme MixⅠ1 μL，終體積為20 μL。加完樣后輕柔混合，短暫離心后37 ℃孵育混合物30 min，最后85 ℃加熱5 s 終止反應。反轉錄產(chǎn)物可直接用于PCR擴增，或于-20℃下保存（

1.2.4 目的基因PCR反應及克隆測序 利用常規(guī)PCR反應對組織樣品中Fas基因進行擴增，PCR反應體系為：Taq DNA聚合酶1.5 μL，10 pmol/L上下游引物各1 μL，10×緩沖液（含Mg2+） 2 μL，2.5 μmol/L dNTP 2 μL，cDNA 2 μL，超純水補足到20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。利用常規(guī)PCR反應對組織樣品中Fas基因進行擴增，將目標片段分別從瓊脂糖凝膠中切下，按照DNA回收試劑盒說明回收目標片段，在T4 DNA連接酶作用下，經(jīng)16 ℃過夜連接pMD18-T載體，用CaCl2法將連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選陽性菌落后，挑取單菌落進行培養(yǎng)，然后從菌液中提取質粒，菌液送往上海華大基因公司測序。

1.2.5 實時定量PCR反應 提取重組質粒pMD18-T-Fas，將線性化純化后質粒用紫外分光光度計測定D260 nm、D280 nm，按下式計算拷貝數(shù)：

拷貝數(shù)（拷貝/mL）=（質粒濃度×6.02×1023）/（649×重組質粒長度）。

式中：6.02×1023為阿氏常數(shù)；649為質粒分子質量為1個堿基的平均分子質量。

將重組質粒濃度稀釋為1010拷貝數(shù)后，在依次稀釋為 108、107、106、105、104、103、102、10，以不同濃度的質粒為模板，進行熒光定量PCR反應，反應體系：SYBR 10 μL，ddH2O 7.2 μL，10 pmol/L上下游引物各0.4 μL，模板 2 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，50個循環(huán)。

反應結束后，計算機自身會根據(jù)質粒濃度與cDNA模板的濃度制作標準曲線。通過此標準曲線來計算質粒濃度。應用MX3000P熒光定量PCR儀進行表達分析。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測阿勒泰羊和湖羊的Fas mRNA表達量 對寒冷應激前后阿勒泰羊及湖羊的頸部肌間脂肪、胸部肌間脂肪、腹部肌間脂肪、腿部肌間脂肪、尾部脂肪和肝臟組織進行實時熒光定量PCR，每個組織進行3次重復。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所測不同樣本的質粒濃度換算成拷貝數(shù)，用SPSS 11.0軟件進行分析，用t檢驗確定Fas基因的表達量，根據(jù)單因素方差分析寒冷應激前后與物種間的相關性。

2 結果與分析

2.1 提取總RNA

總RNA的質量是獲得完整cDNA序列的關鍵因素。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA，28S和18S RNA帶型清晰可見，表明總RNA無降解，完整性較好（圖1）。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計測定后D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA無蛋白質和苯酚污染，純度較高，可用于后續(xù)的試驗。

2.2 Fas基因的RT-RCR擴增

提取湖羊和阿勒泰羊各組織的RNA，采用分光光度計對其進行定量并調整至相同劑量。以RNA反轉錄的cDNA為模板，以Fas的上、下游引物擴增，得到256 bp的條帶（圖2）?？梢钥闯?，各組織的PCR擴增條帶亮度基本一致，說明各個組織的cDNA模板擴增穩(wěn)定。

2.3 Fas基因的mRNA組織表達水平的絕對定量分析

2.3.1 標準曲線的生成 LightCycle根據(jù)所測的質粒濃度自動繪制出標準曲線（圖3至圖5），測得Fas基因的值幾乎在一條直線上，相關系數(shù)是0.998 6，曲線的斜率為-3.274，F(xiàn)as基因的擴增效率為E=10-1/-3.27-1=1.02，而擴增產(chǎn)物的熔解曲線出現(xiàn)了1個主峰，Tm值為（92±0.2）℃；說明所建立的綿羊Fas mRNA定量檢測方法是有效的。

2.4 阿勒泰羊與湖羊在應激前與應激后Fas mRNA在不同組織中的表達量分析

阿勒泰羊在應激后各個部位組織的Fas mRNA表達量均有下降，其中阿勒泰羊的頸部、胸部、腹部、腿部肌間脂肪及尾部脂肪的表達量與應激前差異極顯著（P<0.01）（圖6）。

湖羊在應激后各個組織的Fas mRNA表達量均有下降，其中頸部肌間脂肪、 胸部肌間脂肪、腿部肌間脂肪Fas mRNA

表達量與應激前相比差異顯著（P0.05）（圖6）。

阿勒泰羊各組織在應激前的Fas mRNA表達量均高于湖羊，而兩者在應激后頸部、胸部、腿部肌間脂肪的表達量差異不顯著，腹部肌間脂肪和尾部脂肪相比差異顯著（P

3 結論與討論

機體通過協(xié)調控制有關脂肪合成和分解的酶的活性和基因表達來調節(jié)體脂的沉積，使動物體脂的沉積始終處于一個動態(tài)平衡，F(xiàn)as是體組織脂肪酸再生能力的主要限速酶，在動物體脂沉積中發(fā)揮重要作用，其表達水平的升高能夠顯著增加甘油三酯在體內的沉積[4]。脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，Lpl）是脂質代謝中的關鍵酶[5]，對脂肪沉積具有反作用，主要功能是水解極低密度脂蛋白（VLDL）和乳糜微粒（CM）中的甘油三酯（TG），使之轉變?yōu)樾》肿恿康闹舅?，以供各種組織貯存和利用。

本試驗通過對寒冷應激前后阿勒泰羊和湖羊不同組織Fas mRNA的檢測發(fā)現(xiàn)，各組織的Fas的表達量均呈現(xiàn)下降的趨勢；同時，本試驗前期研究得出寒冷應激后Lpl在阿勒泰羊和湖羊各組織的表達量均顯著升高，其結果可在一定程度上反映機體脂質代謝的規(guī)律，在寒冷應激前Fas表達量較高，促進脂肪沉積；Lpl的表達量較低，阻止了脂肪酸進入脂肪組織沉積，脂肪組織把多余的能量轉變成脂肪儲存起來。而寒冷應激后Fas和Lpl表達量與寒冷應激前相反，機體分解脂肪用以供能并維持體溫的恒定。

多數(shù)研究表明，熱應激可以增加脂肪沉積的趨勢[6-7]，動物的體脂沉積所需要的脂肪酸大多來自脂肪酸的全程合成[3]。劉梅等研究了急性熱應激對肉仔雞Fas mRNA表達的影響，發(fā)現(xiàn)急性熱應激顯著增加了肝臟Fas mRNA相對表達水平，從而促進了肝臟的脂肪酸合成，同時急性熱應激對腹脂F(xiàn)as表達量影響并不顯著[8]。其結果與本試驗結果相反，應激源的相對性和不同物種之間脂肪代謝的調節(jié)機理也不一致。對于寒冷應激對脂肪代謝的研究較少，由本試驗結果可推斷，在寒冷應激下脂肪酸合成減少，脂肪作為能源物質被分解供能，來適應冷刺激。同時，仔雞的肝臟是胴體脂肪酸合成的主要場所，90%胴體脂肪在肝臟中合成[9-11]，而綿羊的脂肪組織是胴體脂肪合成的唯一場所，因此阿勒泰羊與湖羊肝臟Fas mRNA表達量比脂肪組織低。

本試驗選用新疆耐寒品種阿勒泰羊和不耐寒品種湖羊作為試驗對象，全面系統(tǒng)地研究了低溫條件下2種綿羊機體內脂肪組織參與能量代謝的變化過程，比較其脂肪酸合成酶和脂蛋白脂酶在不同品種之間的表達差異，揭示了阿勒泰羊耐寒的可能適應機制，為新疆綿羊抗寒育種工作提供理論依據(jù)。

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