吳文嬙+韋永選+周鑫+黃小龍+許云+黃東益

摘要：炭疽病是大薯生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害，迫切需要可靠的方法來(lái)篩選抗病種質(zhì)。采用薯蕷上分離到的2份炭疽病菌株SY01、DJ01的分生孢子對(duì)大薯Da87、Da115的組培苗進(jìn)行接種，通過(guò)對(duì)病情指數(shù)的比較分析最佳的接種方法。結(jié)果表明：大薯Da87、Da115對(duì)炭疽菌的抗性差異極顯著，菌株SY01、DJ01之間致病力差異極顯著；在篩選的接種方法中，最佳的為使用3×106個(gè)/mL孢子濃度的涂抹法。

關(guān)鍵詞：大薯；炭疽病；接種方法；病情指數(shù)；抗病評(píng)價(jià)

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0174-02

薯蕷家族廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，大薯被公認(rèn)為是薯蕷中分布最廣、最多的種[1]。大薯（Dioscorea alata）別稱(chēng)參薯、腳板薯、菜山藥，為薯蕷屬單子葉藤本植物，在我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)均有種植，是四大薯類(lèi)作物中營(yíng)養(yǎng)最豐富的作物，在非洲一些國(guó)家是僅次于木薯的主糧。

炭疽病發(fā)病可從苗期開(kāi)始一直到采收，嚴(yán)重影響大薯的生長(zhǎng)及薯塊的產(chǎn)量。來(lái)自加勒比、南太平洋、西非和印度等國(guó)家和地區(qū)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，該病嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致產(chǎn)量下降90%，幾種常見(jiàn)的栽培種都缺乏抗性[2-3]。炭疽病（膠孢炭疽菌）引起葉片壞疽并且藤蔓枯萎，導(dǎo)致光合作用表面積的下降并且伴隨著薯蕷塊莖產(chǎn)量的下降。在塊莖形成前或者是形成期間病害的流行對(duì)塊莖產(chǎn)量的影響是極大的。炭疽病可發(fā)生在全株，包括葉片、藤蔓、薯塊，帶病的種薯、土壤會(huì)持續(xù)影響，甚至導(dǎo)致絕種[4]。在我國(guó)南方地區(qū)，高溫多雨的天氣更有利于大薯炭疽病的發(fā)生和發(fā)展。在法國(guó)西部和尼日利亞侵染薯蕷類(lèi)作物的炭疽病病原菌表現(xiàn)出遺傳性和致病性的明顯差異[5-8]。國(guó)內(nèi)外大多采用離體葉片進(jìn)行抗性鑒定，筆者經(jīng)過(guò)多年研究發(fā)現(xiàn)該法并未能完全反映種質(zhì)的抗性水平且重復(fù)性比較差。由于大薯在種植時(shí)主要采用薯塊育苗，進(jìn)行苗期抗性鑒定需要大量的薯塊，且生產(chǎn)周期上無(wú)法滿(mǎn)足準(zhǔn)確可靠的抗病性鑒定的試驗(yàn)要求。用組培苗進(jìn)行大量基因型的快速篩選對(duì)于膠孢炭疽菌的毒力和侵染力的分析是精確有用的[9]，組培苗還可用于栽培種-分離物互作的研究和研究侵染進(jìn)程[10-11]。更進(jìn)一步，組培苗可用于評(píng)價(jià)栽培種對(duì)特定分離物的反應(yīng)。這些對(duì)于非當(dāng)?shù)氐哪z孢炭疽菌的篩選和國(guó)家交流項(xiàng)目的薯蕷評(píng)價(jià)是可行的[12]。因此，本研究欲采用已分離鑒定的炭疽病菌對(duì)大薯組培苗進(jìn)行抗性鑒定，篩選最佳的接種方法。目前，筆者所在課題組已經(jīng)收集了我國(guó)南方地區(qū)160份的大薯種質(zhì)資源，建立了我國(guó)的薯蕷種質(zhì)資源圃，分離鑒定了100株來(lái)自薯蕷的炭疽病菌株，建立快速有效的苗期抗性鑒定方法對(duì)于我國(guó)大薯抗性種質(zhì)資源的篩選十分必要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：DJ01（分離自海南儋州大薯）、SY01（分離自海南海口山藥）；供試大薯：Da87、Da115；盆栽基質(zhì)：營(yíng)養(yǎng)土 ∶ 陶粒 ∶ 草木灰=3 ∶ 1 ∶ 1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大薯組培苗的獲得 以幼嫩的大薯實(shí)生苗的單個(gè)帶節(jié)莖段為外植體，經(jīng)自來(lái)水沖洗30 min，用75%乙醇浸泡15 s，選用0.1%HgCl2處理8～10 min，再用無(wú)菌水洗3～5次。將消毒好的帶芽莖段接種到培養(yǎng)基（MS+3%蔗糖+03%植物凝膠，pH值5.8）中。無(wú)菌苗培養(yǎng)2個(gè)月，選擇長(zhǎng)出5～8張葉且已生根的材料進(jìn)行煉苗。煉苗1周后移栽至營(yíng)養(yǎng)缽，待植株葉片開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng)后進(jìn)行接種。

1.2.2 接種菌孢子的制備 先將菌種接在PDA 平板上進(jìn)行活化，在28 ℃下培養(yǎng)7 d，經(jīng)過(guò)過(guò)濾純化后收集孢子配置懸浮液。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法將供試菌株的孢子懸浮液分別配制成3個(gè)濃度：3×105、 3×106、3×107個(gè)/mL。

1.2.3 接種方法 接種采用噴霧法、多針接種法、涂抹法進(jìn)行試驗(yàn)。采用2種菌株接種2種大薯種質(zhì)，分別用上述3種濃度處理，每個(gè)處理10株苗，設(shè)置3株接種水作為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。接種時(shí)室溫為（26±2） ℃，用塑料薄膜覆蓋，黑暗保濕2 d，之后揭開(kāi)覆蓋，自然光照下培育。接種12 d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病情況及統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。

1.2.4 病葉分級(jí) 大薯炭疽病室內(nèi)苗期抗病性調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)癥狀；1級(jí)，病斑直徑0～1.0 mm，有1～2張葉發(fā)病；2級(jí)，病斑直徑在11～20 mm，有2張真葉發(fā)病，或有少數(shù)大斑；3級(jí)，病斑直徑在21～30 mm，并產(chǎn)生孢子，或有2張以上葉片發(fā)病，病株出現(xiàn)落葉，株形不正常；4級(jí)，有許多大斑，大量產(chǎn)生孢子，病株大量落葉，近枯死或枯死。

（1）病情指數(shù)。將參試品種的發(fā)病級(jí)別按病情指數(shù)計(jì)算式換算成該種質(zhì)的病情指數(shù)，換算公式如下：病情指數(shù)（DI）=∑（株數(shù)×病級(jí)數(shù)）/（總株數(shù)×最高病級(jí)數(shù)）×100。

（2）抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。薯蕷種質(zhì)炭疽病抗性鑒定分為6個(gè)等級(jí)[13]：1級(jí)，免疫（immune，I），DI=0；2級(jí)，高抗（highly resistant，HR），080。

1.2.5 菌株致病性分級(jí) 菌株致病性類(lèi)型劃分標(biāo)準(zhǔn)如下[14]：強(qiáng)（A）：平均病情指數(shù)40.1～ 100.0；中（B）：平均病情指數(shù) 20.1～ 40.0；弱（C）：平均病情指數(shù)0.1～20.0；無(wú)致病力（D）：平均病情指數(shù)為0。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行Duncanss測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大薯種質(zhì)的炭疽病抗性鑒定

不同處理下大薯種質(zhì)的病情指數(shù)均值（表1）表明：大薯種質(zhì)Da115、Da87對(duì)炭疽病的抗性為中感（MS），Da115、Da87的病情指數(shù)差異極顯著，Da115較Da87更易感病。

2.2 薯蕷炭疽菌菌株的致病力檢測(cè)

由表2不同處理下薯蕷炭疽菌菌株致病后引起的病情指數(shù)均值表明：薯蕷炭疽菌菌株DJ01、SY01的致病性為中致病性，二者的致病力差異極顯著，菌株DJ01的致病力較強(qiáng)。

2.3 不同接種菌液孢子濃度和不同接種方法對(duì)大薯炭疽病發(fā)病情況的影響

表3的2份炭疽菌菌株的3種孢子濃度接種2份大薯種質(zhì)后的病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：多針接種法和涂抹法的不同孢子濃度接種后病情指數(shù)差異均達(dá)到了極顯著水平；噴霧法的孢子濃度水平為 3×105、3×106個(gè)/mL之間差異未達(dá)到極顯著水平。當(dāng)孢子濃度水平為3×105個(gè)/mL時(shí)，涂抹法和噴霧法的病情指數(shù)較低，且差異不顯著，未達(dá)到大薯種質(zhì)病情指數(shù)的均值，不適于進(jìn)行抗病性鑒定。當(dāng)孢子濃度水平為3×106、3×107個(gè)/mL時(shí)，3種接種方法的病情指數(shù)差異均達(dá)到了極顯著水平。綜合來(lái)看，多針接種法發(fā)病早，病情指數(shù)均高于2份大薯種質(zhì)的平均病情指數(shù)和2份炭疽菌菌株的平均致病力，當(dāng)孢子濃度水平為3×107個(gè)/mL時(shí)病情指數(shù)均值高達(dá)90.26，接近死亡，因此多針接種法不適合用于大薯種質(zhì)的抗病性鑒定。噴霧法總體的病情指數(shù)較低，需要較高的孢子濃度才能達(dá)到適合的病情指數(shù)。當(dāng)孢子濃度為3×106個(gè)/mL時(shí)，涂抹法的病情指數(shù)與大薯種質(zhì)的平均病情指數(shù)和炭疽菌平均致病力較一致。因此最佳的接種方法為涂抹法，孢子濃度水平為3×106個(gè)/mL。

3 結(jié)論與討論

目前，活體接種的結(jié)果能較充分地反映植株對(duì)病原菌的抗性，室內(nèi)接種鑒定方法的研究能為抗性種質(zhì)篩選提供可靠的依據(jù)。Onyeka等用3份大薯炭疽菌分離物（膠孢炭疽菌）來(lái)評(píng)價(jià)60份大薯栽培種的組培苗反應(yīng)，認(rèn)為組培苗提供了用于評(píng)價(jià)大量大薯種質(zhì)的快速、可靠和健全的方法，可進(jìn)一步用于田間的測(cè)試，這項(xiàng)技術(shù)降低了大量株系所需要的大面積土地[12]。Akem用噴霧法接種大薯抗病種質(zhì)Dan087、TDa86/00620、TDa316以及感病種質(zhì)TDa85/00257、TDa86/00607、TDa85/00250進(jìn)行致病性試驗(yàn)，每個(gè)植株用2mL孢子濃度為1.6×106個(gè)/mL的孢子懸浮液噴霧接種，28 d后觀察并記錄植株的感病情況[15]。炭疽病菌孢子雖然是接種在活體植株上，但是發(fā)病周期較長(zhǎng)。陳吉良采用大薯和山藥的離體葉片進(jìn)行菌株致病性鑒定和植株的抗性初篩，初篩結(jié)果往往與田間的抗性鑒定不一致，這可能與田間環(huán)境有較大差異相關(guān)，也可能是離體葉片與活體植株的差異導(dǎo)致的[16]。本試驗(yàn)中對(duì)于同一份材料的抗病等級(jí)是基于不同處理下病情指數(shù)的均值，在3種接種方法中基于這個(gè)均值進(jìn)行衡量，多針接種法發(fā)病快、發(fā)病較嚴(yán)重，但是較難比較種質(zhì)之間的抗性差異；噴霧法發(fā)病較慢，需要較多的孢子進(jìn)行侵染；相比之下，涂抹法較適中。在3種孢子濃度侵染時(shí)，孢子濃度為3×105個(gè)/mL時(shí)，僅在多針接種法中表現(xiàn)出較高的病情指數(shù)，而在涂抹法和噴霧法中均表現(xiàn)為較低的病情指數(shù)；濃度為3×106個(gè)/mL時(shí)，多針接種法有較高的病情指數(shù)，而噴霧法有較低的病情指數(shù)，涂抹法較適宜；濃度為3×107個(gè)/mL時(shí)，多針接種法接種的植株接近死亡，適宜用涂抹法和噴霧法。因此，本研究表明，當(dāng)孢子濃度水平為3×106個(gè)/mL時(shí)，涂抹法最適宜大薯組培苗的抗病性鑒定。

參考文獻(xiàn)：

[1]Anon. Annual report of project 13：Improvement of yam-based systems[R]. Ibadan，Nigena：IITA，1998.

[2]Winch J E，Newhook F J，Jackson G V H，et al. Studies of Colletotrichum gloeosporioides disease on yam，Dioscorea alata，in the Solomon Islands[J]. Plant Pathology ，1984，33（4）：467-477.

[3]McDonald F D，Alleyne A T，Ogarro L W，et al.Yam anthracnose in the English-speaking islands of the Eastern Caribbean-successes and research advances in disease management[J]. Tropical Agriculture，1998 75：53-57.

[4]Kutama A S，Auyo M I，Binta S B，et al. Combating yam anthracnose in Nigeria：a review[J]. Standard Research Journal of Agricultural Science，2013，1（3）：21-26.

[5]Abang M M，Hoffmann P，Winter S，et al. Vegetative compatibility among isolates of Colletotrichum gloeosporioides from yam（Dioscorea spp.） in Nigeria[J]. Journal of Phytopathology，2004，152（1）：21-27.

[6]Abang M M，F(xiàn)agbola O，Smalla K，et al. Two genetically distinct populations of Colletotrichum gloeosporioides Penz.causing anthracnose disease of yam（Dioscorea spp.）[J]. Journal of Phytopathology，2005，153（3）：137-142.endprint

[7]Frézal L，Jacqua G，Neema C. Etude de la diversite genetique de Colletotrichum gloeosporioides，agent causal de lanthracnose de ligname blanche en Guadeloupe.[C]//Tours，F(xiàn)rance：Proceedings of the 7th International Conference on Plant Diseases，2003.

[8]Frézal L. Etude de la diversité génétique de Colletotrichum gloeosporioides，responsable de Ianthracnosse de Iigname alata （Dioscorea alata） en Guadeloupe[D]. Paris，F(xiàn)rance：Université de Paris-Sud，2005.

[9]Abang M M，Green K R，Wanyera N W，et al.Characterization of Colletotrichum gloeosporioides Penz. from yam （Dioscorea spp.） in Nigeria[C]. Ibadan，Nigeria：I Proceedings of the 7th Triennial Symposium of the International Society for Tropical Root Crops，African Branch，1998：613-615.

[10]Green K R，Abang M M，Iloba C. A rapid bioassay for screening yam germplasm for response to anthracnose[J]. Tropical Science ，2000，40：132-138.

[11]Onyeka T J，Petro D，Etienne S，et al. Optimizing controlled environment assessment of levels of resistance to yam anthracnose disease using tissue culture-derived whole plants[J]. Journal of Phytopathology，2006，154（5）：286-292.

[12]Onyeka T J，Pétro D， Ano G，et al.Resistance in water yam（Dioscorea alata） cultivars in the french west indies to anthracnose disease based on tissue culture-derived whole-plant assay[J]. Plant Pathology，2006，55（5）：671-678.

[13]王 智. 山藥種質(zhì)資源抗性鑒定、抗病機(jī)制研究和遺傳多樣性分析[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[14]李 越，劉云龍，李 凡，等. 非洲菊根腐病品種抗病性鑒定及病原菌的致病性分化[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，23（1）：33-35，41.

[15]Akem C N. Yam die-back and its principal cause in the yam belt of Nigeria[J]. Pakistan Journal of Biological Science，1999，2（4）：1106-1109.

[16]陳吉良. 薯蕷炭疽病病原菌分離鑒定及抑菌制劑的篩選[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2011. 柴 虹，潘海珠，胡 浩. 酪酸梭菌與糞腸球菌的混合培養(yǎng)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：279-280.endprint