通信作者：張維農(1969-)，男，教授，E-mail：zhangweinong@163.com.

高脂血癥血清脂肪酸分析

劉小珊，趙秀舉，胡志雄，齊玉堂，張維農

(武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023)

摘要：探討高脂血癥小鼠血清脂肪酸水平的變化。以高脂血癥小鼠為模型，以生化檢測指標為基礎，通過GC—MS檢測技術監(jiān)測基礎組、高脂組及配方油脂干預組小鼠血清脂肪酸的差異。將50只SPF級KM系雄性小鼠隨機分為基礎組、高脂組、配方油低中高劑量組。連續(xù)喂養(yǎng)4周，提取小鼠血清，檢測血清生化指標，并使用氣相色譜—質譜聯(lián)用技術檢測其脂肪酸的種類與含量。結果表明，成功建立高脂血癥小鼠模型，且小鼠血清脂肪酸種類并無差別；而與基礎組比較，高脂組C14∶0、C16∶1、C18∶1、C22∶6的含量有顯著性差異；與高脂組相比，配方油組各脂肪酸含量均有不同程度變化，其中C16∶1、C18∶1、C22∶6的含量變化趨勢顯著(P<0.05)；且不飽和脂肪酸比例在各組之間也有顯著性差異。根據(jù)GC—MS(氣質聯(lián)用)監(jiān)測結果可知，C16∶1、C18∶1、C22∶6三種脂肪酸在各組之間變化顯著，與高脂血癥代謝異常有關，血清不飽和脂肪酸比例與高脂血癥關系密切。

關鍵詞：高脂血癥；血清脂肪酸；GC—MS；不飽和脂肪酸

收稿日期：2015-03-23.修回日期：2015-05-12.

作者簡介：劉小珊(1989-)，女，碩士研究生，E-mail：13554338623@163.com.

基金項目：國家自然科學

文章編號：2095-7386(2015)03-0025-06

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.03.006

中圖分類號：R 589.2

Research on biomarkers in serum fatty acids of hyperlipidemia

LIUXiao-shan,ZHAOXiu-ju,HUZhi-xiong,QIYu-tang,ZHANGWei-nong

(School of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：To explore the differences of serum free fatty acids (FFA) of hyperlipidemia.Based on the hyperlipidemia model, the biochemical detection index, looking at the differences of serum fatty acids of group, fat group, formula oil low, medium, high dose groups. After continuously feeding four weeks, the serum was taken, the biochemical indexes were detected and the content of fatty acids were detected with gas chromatography-mass spectrometry. The results showed that the model of hyperlipidemia was successfully established and there was no species difference in all these fatty acids. Compared with the basic group, the content of C14∶0,C16∶1,C18∶1,C22∶6 of high-fat group were significantly different. Compared with the high-fat group, the fatty acid of formula oil groups varied on some degrees, and the diversification of C16∶1、C18∶1、C22∶6 was significantly. The ratio of unsaturated fatty acid was significantly difference between the groups. Based on GC-MS monitoring results, we could know that C16∶1,C18∶1,C22∶6 changed significantly between the groups, and could be related with the abnormal metabolism of hyperlipidemia, and the proportion of unsaturated fatty acids in serum had a close relationship hyperlipidemia.

Key words：hyperlipidemia; serum fatty acids; GC-MS; unsaturated fatty acids

1引言

游離脂肪酸即非酯化脂肪酸或未酯化脂肪酸是人體內重要活性物質，參與多種生理功能，代謝活性高且易受脂肪代謝影響；隨著血清游離脂肪酸與疾病關系的研究不斷深入，已證實游離脂肪酸，尤其是不飽和脂肪酸[1-2]與很多系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有關。有研究顯示血清中脂肪酸組成能反映某些疾病特點，飽和脂肪酸有促進血小板聚集作用，可誘發(fā)冠狀動脈急性阻塞而導致心肌梗塞；不飽和脂肪酸中的亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸屬于必需脂肪酸，對人體有重要作用[3-8]。臨床醫(yī)學證實血清游離脂肪酸的濃度變化與很多疾病有關。因此測定人體中脂肪酸含量，尋找潛在疾病標志物，對于疾病預防控制、治療有意義[9-10]。筆者在血清生化檢測結果的基礎上，研究功能性油脂干預后的各組小鼠血清脂肪酸的差異，期待找到與高脂血癥血清脂質代謝異常相關的物質，為進一步深入研究提供參考。

2材料與方法

2.1材料與試劑

SPF級KM系小鼠60只，18—20 g，雄性，由湖北省疾控中心實驗動物研究中心提供；功能性油脂：配方油(85%米糠油、10%亞麻籽油、5%玉米油)，中興能源湖北有限公司提供；動物基礎飼料,華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心；康德牌蛋黃粉,江蘇南通康德生物制品有限公司；新鮮豬油,武商量販常青店；膽鹽3號,國藥集團試劑有限公司；膽固醇(純度大于95%),Aladdin公司；高脂飼料(自制),配比為78.8%的基礎飼料粉料、10%的豬油、10%的蛋黃粉、0.2%膽鹽3號、1%膽固醇；正己烷(色譜純),天津市科密歐化學試劑有限公司；濃硫酸(分析純) 、甲醇(分析純)、氯化鈉(分析純),天津市天力化學試劑有限公司；總膽固醇試劑盒(酶法)、甘油三酯試劑盒(酶法)、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒(選擇性沉淀法)、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒(選擇性沉淀法),北京北化康泰臨床試劑有限公司；葡萄糖測定試劑盒(葡萄糖氧化酶法),中生北控生物科技股份有限公司。

2.2儀器與設備

XW-80A微型漩渦混合儀,上海滬西分析儀器廠有限公司；ACS-3JZ電子計重秤,中山市衡新電子有限公司；TGL-16G 臺式離心機,上海安亭科學儀器廠制造；DZF-6021型真空干燥箱,上海精宏實驗設備有限公司；Agilent7890GC/5975C氣相色譜質譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司。

2.3實驗方法

2.3.1動物分組與喂養(yǎng)

60只SPF級昆明系雄性小鼠18 g左右在25 ℃，濕度為70%的環(huán)境下適應10 d，淘汰掉體重較平均值低以及病態(tài)的小鼠10只。適應期間全部喂養(yǎng)基礎飼料和飲用水，自由取食。適應期后將剩下的50只小鼠隨機分為5組(A—E組)，每組10只。其中A組在實驗期間喂養(yǎng)基礎飼料，剩余組均喂養(yǎng)高脂飼料(78.8%基礎飼料、1%膽固醇、0.02%3號膽鹽、1%蛋黃粉、10%豬油)。

此外C—E組小鼠每天定點灌胃配方油(85%米糠油、10%亞麻籽油、5%玉米油)，喂養(yǎng)4周。分組情況和劑量設置如表1所示。

表1小鼠實驗分組與劑量/(mL/10g)

2.3.2小鼠血清的提取

禁食12 h后，對小鼠采取摘除眼球法取血，隨后引頸處死。采集的血液4 ℃靜置30 min以上，3 000 r/min離心10 min，取上層血清并轉移到液氮中保存，最后將所有分離出的血清轉移到-80 ℃條件下保存待測。

2.3.3小鼠血清血生化檢測

血清中需要檢測的指標主要有總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。采用酶法試劑盒來檢測血脂的各項指標[11]，根據(jù)測量結果判定血脂調節(jié)效果。

2.3.4小鼠血清甲酯化

甲酯化方法參照李海靜[1]、馬曉麗[2]的實驗方法。取血清樣品100 μL于EP管中，加1 mL 10% H2SO4和甲醇混合溶液，渦勻震蕩。于70 ℃恒溫水浴30 min，結束后冷卻至室溫，在試管中加入1 mL正己烷和1 mL飽和食鹽水，震蕩萃取，3 000 r/min離心10 min，取上層正己烷，N2吹干，用100 μL正己烷復溶后，待用。

2.3.5氣相色譜—質譜分析

色譜條件：HP-FFAP石英毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；采用程序升溫法：起始溫度為100 ℃，保持1 min，然后以3 ℃/min升到220 ℃，保持29 min。載氣為N2。質譜條件：電子能量70 eV，傳輸溫度250 ℃，離子源溫度220 ℃，電離方式EI-，質量掃描范圍m/z50—800。

2.3.6數(shù)據(jù)處理

3結果與討論

3.1各組血清生化指標檢測結果

本實驗功能性油脂的降脂功效以生化檢測結果為依據(jù)，各組小鼠血清的TC、TG、LDL-C、HDL-C含量整理見表2。(1)總膽固醇：與空白組相比，高脂組血清TC水平有極顯著差異，說明高脂組小鼠在飼養(yǎng)高脂飼料期間TC水平明顯升高。與高脂組相比，配方油高、中劑量組有顯著差異，說明配方油能顯著減少TC水平。(2)總甘油三酯：與空白組相比，高脂組小鼠血清中TG水平有極顯著差異。與高脂組相比，配方油高低劑量組有顯著性差異，說明配方油能降低血清TG水平。(3)低密度脂蛋白膽固醇：與空白組相比，高脂組小鼠血清LDL-C水平有極顯著差異。與高脂組相比，低劑量配方油組有顯著性差異。(4)高密度脂蛋白膽固醇：與空白組相比，高脂組小鼠血清HDL-C水平有極顯著差異；與高脂組相比，配方油各劑量組均顯著升高血清HDL-C水平。根據(jù)以上分析結果可知：配方油有輔助降血脂功效。

3.2基礎組、高脂血癥組、配方油脂干預組脂肪酸檢測結果

3.2.1各組小鼠血清脂肪酸定量分析

表2　各組小鼠血脂指標　/(mmol/L)

注：(1)■■與A組比較有極顯著差異(P<0.01)；(2)■與A組比較有顯著差異(P<0.05)；(3)##與B組比較有極顯著差異(P<0.01)；(4)#與B組相比有顯著差異(P<0.05)。

在該實驗條件下，各組小鼠血清游離脂肪酸都可以得到完全分離，各組均檢測到C14∶0、C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C20∶3、C20∶4、C22∶6。各組小鼠血清脂肪酸只有量的差異，無種類差異。

使用峰面積歸一法，測得各組小鼠血清脂肪酸相對百分含量，詳見表3。

(1)B組(高脂組)與A組(基礎組)相比較，C14∶0、C16∶1有顯著性差異(P<0.05)，C18∶1、C22∶6有極顯著性差異(P<0.01)。C16∶0、C18∶0、C18∶2、C20∶3、C20∶4都有不同程度的差異，但是差異不顯著(P>0.05)。綜上可知高脂組相對于基礎組而言C14∶0、C16∶1、C18∶1、C22∶6四種脂肪酸變化顯著。

(2)C—E組與B組比較，C14∶0的含量有上升趨勢，但是C—E組C14∶0整體與B組比較差異不顯著；C16∶1的含量有下降趨勢，其中D、E組差異顯著(P<0.05)，C組差異極顯著(P<0.01)；C18∶1的含量整體下降，C—E組差異均顯著(P<0.05)；C22:6含量上升，且C—E組差異顯著(P<0.05)；而剩余五種被檢測出的脂肪酸在C—E組與B組之間雖然也產生差異，但是差異不顯著。綜上可知C—E組也即配方油干預組相對于B組也即高脂組而言，C16∶1、C18∶1、C22∶6三種脂肪酸變化顯著。

表3小鼠血清脂肪酸相對含量的變化

脂肪酸ABCDEC14:01.228±0.0750.672±0.245▲0.796±0.0560.878±0.3100.928±0.198C16∶031.402±2.83228.009±2.38827.663±0.83828.941±0.38232.206±6.793C16∶11.237±0.2062.850±0.939▲0.581±0.224◆◆0.766±0.052◆0.858±0.129◆C18∶015.844±0.53017.360±0.93716.550±0.48317.134±0.37216.612±2.318C18∶19.463±1.08813.414±0.894▲▲11.371±0.897◆11.308±0.972◆9.805±2.100◆C18∶218.510±2.39619.183±1.59721.247±0.74919.370±1.13717.693±2.149C20∶32.090±0.4272.197±0.6343.896±0.691◆3.912±0.676◆4.138±0.943◆C20∶48.880±1.02512.067±1.93811.358±0.88511.533±0.63211.990±2.745C22∶68.853±0.4084.248±0.289▲▲6.537±1.261◆6.157±0.853◆5.770±0.998◆

(1)▲▲與A組比較有極顯著差異(P<0.01)；(2)▲與A組比較有顯著差異(P<0.05)；(3)◆◆與B組比較有極顯著差異(P<0.01)；(4)◆與B組相比有顯著差異(P<0.05)。

C16∶1，C18∶1和C22∶6三種脂肪酸水平對比圖見圖1，圖2和圖3。

圖1　各組小鼠C16∶1水平

圖2　各組小鼠C18∶1水平

圖3　各組小鼠C18∶1水平

從以上分析結果可知，C16∶1、C18∶1、C22∶6三種脂肪酸在各組之間變化具有規(guī)律性，且有統(tǒng)計學意義，功能性油脂具有減小高脂組與基礎組間差別的作用。說明C16∶1、C18∶1、C22∶6這3種脂肪酸與高脂血癥代謝異常有著密切關系。

3.2.2各組小鼠血清不同類型脂肪酸差異

根據(jù)表3的統(tǒng)計結果，將每組脂肪酸進行分類，分析各組小鼠血清不同類型脂肪酸的變化情況，見表4。

(1)B組和A組比較，MUFA、MUFA/UFA、PUFA/UFA含量有極顯著性差異(P<0.01)，SFA、UFA、PUFA、SFA/UFA差異不顯著(P>0.05)。說明B組也即高脂組相對于A組也即基礎組而言，MUFA、MUFA/UFA、PUFA/UFA變化顯著。

(2)C—E組與B組比較， MUFA含量整體下降，其中C—E組變化均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；PUFA/UFA含量上升，C—E組變化都有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)；而MUFA/UFA只有E組變化具有統(tǒng)計學意義，C組、D組變化沒有統(tǒng)計學意義；SFA、UFA、PUFA、SFA/UFA變化不顯著(P>0.05)。綜上可知MUFA、PUFA/UFA、MUFA/UFA在高脂組與配方油干預組之間的變化較顯著。

不飽和脂肪酸含量在各組之間有顯著性差異，各類不飽和脂肪酸的比例分配在各組之間也具有顯著性差異。得出某一類脂肪酸尤其是不飽和脂肪酸也可能作為研究高脂血癥的一個關注點。

表4小鼠血清脂肪酸的分類比較

脂肪酸ABCDESFA(飽和脂肪酸)49.894±2.78146.041±2.44045.009±0.47446.953±0.06149.746±6.944UFA(不飽和脂肪酸)50.106±2.78153.960±2.44054.991±0.47453.047±0.06150.254±6.944MUFA(單不飽和脂肪酸)10.667±1.14616.264±1.206★★11.953±1.106●●12.074±0.982●●10.663±2.208●●PUFA(多不飽和脂肪酸)39.439±1.74837.695±3.21543.038±1.576●40.973±1.04139.591±4.858SFA/UFA1.000±0.1100.856±0.0850.819±0.0160.885±0.0021.018±0.300MUFA/UFA0.213±0.0130.302±0.031★★0.217±0.0220.228±0.0190.211±0.017●●PUFA/UFA0.787±0.0130.698±0.031★★0.783±0.022●●0.772±0.019●0.789±0.017●●

(1)★★與A組比較有極顯著差異(P<0.01)；(2)★與A組比較有顯著差異(P<0.05)；(3)●●與B組比較有極顯著差異(P<0.01)；(4)●與A組比較有顯著差異(P<0.05)。

4結論

血清中FFAs在健康狀態(tài)下處于相對平衡狀態(tài)，只有疾病狀態(tài)下導致某個系統(tǒng)功能紊亂，血清脂肪酸平衡狀態(tài)被打破，其組成才會發(fā)生改變[12]。胰島素抵抗[13-14]、糖尿病[15-17]等多種代謝疾病都存在血清游離脂肪酸升高的現(xiàn)象。其機理是，脂肪細胞增生，脂肪體積增大，腫瘤壞死因子等細胞因子表達增多，脂肪分解速率明顯增加，脂肪代謝紊亂，大量FFA進入血清，引起高FFA血癥。血清游離脂肪酸跟其他血脂相比，能更靈敏，更早，更準確地反映機體血脂代謝紊亂狀況，不同脂肪酸在脂質代謝中所表現(xiàn)作用不同，因此對血清游離脂肪酸進行檢測可以發(fā)現(xiàn)早期脂質代謝異常，起到預警作用[18]。單不飽和脂肪酸可降低心血管疾病的發(fā)病率， n-3和n-6PUFAs可降低血清甘油三酯水平，預防心血管疾病[19-21]。

本研究中，高脂組C16∶1、C18∶1、C22∶6相對于基礎組差異顯著 ，配方油干預組相對于高脂組而言，C16∶1、C18∶1、C22∶6三種脂肪酸含量變化也顯著，可得出C16∶1、C18∶1、C22∶6與高脂血癥脂質代謝異常有密切關系。而MUFA、MUFA/UFA、PUFA/UFA變化也較顯著，高脂組MUFA顯著高于基礎組，PUFA/UFA顯著低于基礎組，得出不僅各種血清脂肪酸含量多少對生理功能有影響，各類脂肪酸占總脂肪酸比例也應得到重視，尤其是不飽和脂肪酸。

綜上所述，血清中C16∶1、C18∶1、C22∶6含量隨飲食改變產生的變化顯著，可做為疾病早期血清脂肪酸變化的敏感指標物。由于疾病組游離血清脂肪酸譜較正常組發(fā)生改變，為更好地控制疾病的發(fā)生以及更好地進行疾病的后期治療，應對血清脂肪酸水平的變化加以關注，做到早發(fā)現(xiàn)早干預、早治療。

參考文獻：

[1]李海靜, 吳勝明, 方均健, 等. 氣質聯(lián)用法測定人血清游離脂肪酸[J]. 質譜學報, 2009, 30(2): 84-87.

[2]馬曉麗, 田蘭, 李琳琳, 等. 基于氣相色譜的血清中游離脂肪酸代謝輪廓分析區(qū)分糖尿病與正常人[J]. 分析科學學報, 2013, 29(5): 615-619.

[3]徐惠珠, 張偉利, 陳瑞冠. 氣相色譜法測定人體血液中游離脂肪酸[J]. 營養(yǎng)學報, 1986, 8(2): 165-170.

[4]許自超, 李曉曄, 蔣靜霞, 等. 氣相色譜法測定惡性血液病患者血漿中游離脂肪酸的含量[J]. 色譜, 1994, 12(4): 268-269.

[5]王俊義, 許自超, 李曉曄, 等. 脂肪乳劑Intralipid對全胃切除后病人脂肪酸代謝的影響[J]. 中國臨床營養(yǎng)雜志, 1994, 2(4):163-166.

[6]何桂珍, 蔣朱明. 兩種測定血漿非酯化脂肪酸方法的比較[J]. 中國臨床營養(yǎng)雜志, 1994, 2(2): 69-80.

[7]胡永獅, 楊巷菁. 氣相色譜法測定血清中游離脂肪酸及其在臨床中的應用[J]. 色譜, 1990, 8(1): 59-60.

[8]王傳豐, 陳瑞冠, 劉紅, 等. 脂肪組織和血漿標本中脂肪酸的氣相色譜分析[J]. 營養(yǎng)學報, 1990, 12(4): 398-404.

[9]李向慧. 血清中脂肪酸標記物GC-MS分析方法的建立及應用研究[D]. 溫州: 溫州醫(yī)學院, 2013.

[10]應珊紅, 欒霞, 安友仲. 氣相色譜法測定手術前后人體血漿中游離脂肪酸含量的變化[J]. 現(xiàn)代儀器, 2000(3): 30-33.

[11]中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司編著. 全國臨床檢驗操作教程[M]. 南京: 東南大學出版社, 2006.

[12]Bahrami G, Ghanbarian E, Masoumi M, et al. Comparison of fatty acid profiles of aorta and internal mammary arteries in patients with coronary artery disease[J]. Clin Chim Acta, 2006, 370(1/2): 143-146.

[13]Kim JY, Park JY, Kim OY, et al. Metabolic profiling of plasma in overweight/obese and lean men using ultra performance liquid chromatography and Q-TOF mass spectrometry (UPLC-Q-TOF MS)[J]. J Proteome Res, 2010, 9(9): 4368-4375.

[14]高青松, 劉源, 趙爽, 等. 不同類型脂肪酸對SD大鼠血清脂肪酸及胰島素抵抗的影響[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2010, 20(5): 50-56.

[15]Liu L, Li Y, Guan C, et al. Free fatty acid metabolic profile and biomarkers of isolated post-challenge diabetes and type 2 diabetes mellitus based on GCMS and multivariate statistical analysis[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed life Sci, 2010, 878(28): 2817-2825.

[16]辛衍代. 基于GC-MS技術高脂飲食干預的肥胖抵抗大鼠代謝組學研究[D]. 濟南: 濟南大學, 2012.

[17]李嘉強, 戴穎秀, 劉玉敏, 等. 高血壓患者血清脂聯(lián)素與游離脂肪酸、糖及脂代謝[J]. 高血壓雜志, 2006, 14(5): 352-355.

[18]韓雪玲, 于海濤, 胡麗貞, 等. GCMS方法檢測超重/肥胖男性青年血清游離脂肪酸代謝譜[J]. 營養(yǎng)學報, 2013, 35(2): 137-141.

[19]張堅, 孟麗蘋, 姜元榮, 等. 中國成人膳食脂肪酸攝入和食物來源狀況分析[J]. 營養(yǎng)學報, 2009, 31(5): 424-427.

[20]Rajni Chopra, Kari Sambaiah. Effects of rice bran oil enriched with n-3 PUFA on liver and serum lipids in rats [J]. Lipids, 2009, 44(1): 37-46.

[21]Arne Nord?ya, Roberto Marchioli, Harald Arnesenc, et al. n-3 Polyunsaturated Fatty Acids and Cardiovascular Diseases: To Whom, How Much, Preparations [J]. Lipids, 2001, 36(1): 127-129.