李勝民，王軍

（北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所、醫(yī)療器械檢驗(yàn)與安全性評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 101111）

人體血清中總鈣含量的高低是人體健康狀況的重要指標(biāo)，其與人體的多種疾病密切相關(guān)［1–5］。目前測(cè)定血清中鈣的常規(guī)方法很多，不同方法的檢測(cè)結(jié)果差異很大。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室通常自建參考方法，通過(guò)參加實(shí)驗(yàn)室間的量值比對(duì)保證不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

同位素稀釋質(zhì)譜法是國(guó)際公認(rèn)的權(quán)威測(cè)量方法［6］，同位素稀釋質(zhì)譜法通常需要用多接收ICP–MS先測(cè)定濃縮同位素的豐度比值，并計(jì)算濃縮同位素的濃度［7–10］，而多接收ICP–MS儀器價(jià)格高昂，普通實(shí)驗(yàn)室無(wú)力購(gòu)置。

筆者在LGC同位素稀釋法原理［11–13］基礎(chǔ)上建立了反應(yīng)池–兩步同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定血清總鈣的參考方法。與常規(guī)同位素稀釋法相比，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于定值過(guò)程中不必先標(biāo)定濃縮同位素的濃度，僅通過(guò)測(cè)定選定的一對(duì)同位素豐度比值，即可測(cè)定血清中鈣的濃度，大幅降低了實(shí)驗(yàn)對(duì)儀器性能的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：Elan DRC-e型，美國(guó)Perkin Elmer 公司；

電子天平：XS205型，瑞士Mettler Toledo公司；

超純水機(jī)：Mili-Q Adventage型，美國(guó)Millipore公司；

碳酸鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號(hào)為SRM915b，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院；

人血清成分電解質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號(hào)為SRM 956c，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院；

冷凍人血清中無(wú)機(jī)成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號(hào)為GBW 09152，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

42CaCO3：純度為94.37%，編號(hào)為139691，美國(guó)橡樹(shù)嶺實(shí)驗(yàn)室；

硝酸：BV–III級(jí)，北京化學(xué)試劑研究所；

實(shí)驗(yàn)用水由Mill Q超純水系統(tǒng)制備。

1.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀工作參數(shù)

ICP射頻電壓：1 100 V；霧化器氣體流量：0.97 L／min；離子透鏡電壓：6.75 V；模擬信號(hào)電壓：–1 700 V；脈沖信號(hào)電壓：900 V；延遲時(shí)間：2 ms；掃描方式：峰高；掃描次數(shù)：25；單次測(cè)量讀取次數(shù)：25；重復(fù)次數(shù)：25；甲烷流量：0.9 mL／min；氬氣流量：0.8 mL／min；測(cè)量質(zhì)量數(shù)：42和44；冷卻水溫：20℃；進(jìn)樣流量：1 mL／min；分析模式：同位素比。

1.3 溶液的制備

一級(jí)鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將稱量瓶洗凈烘干，冷卻后直接倒入大于0.20 g的CaCO3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粉末，于105℃下烘干2 h。取出冷卻，于干凈容器中稱取0.12 g的CaCO3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加入2 mL的BV–III級(jí)濃硝酸，溶解后加超純水稀釋至總質(zhì)量約為45 g，保存?zhèn)溆谩６ㄖ登捌叫信渲?份一級(jí)鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，以進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，3份溶液濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于1%。

二級(jí)鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取15 mL一級(jí)鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋至45 mL，配制成二級(jí)鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋前后的量值以天平稱量的質(zhì)量為計(jì)算量。

一級(jí)濃縮同位素稀釋劑的配制：稱取約1 mg的42Ca同位素于干凈容器中，加入0.20 mL BV–III級(jí)濃硝酸，加超純水稀釋至總質(zhì)量約為100 g，保存?zhèn)溆谩?/p>

二級(jí)濃縮同位素稀釋劑配制：取1 mL一級(jí)濃縮同位素稀釋劑，用超純水稀釋至45 mL。

鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液與濃縮同位素稀釋劑混合樣品的制備：分別稱取mzc(約0.15 mL)的二級(jí)鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液與mYc(約0.20 mL)的“二級(jí)濃縮同位素稀釋劑”混合后用超純水稀釋到45 mL，兩種試劑的加入量均稱重并以質(zhì)量帶入計(jì)算。

血清樣品與濃縮同位素稀釋劑混合樣品的制備：分別稱取0.3～0.5 mL（mzg）的血清樣品，與0.20 mL二級(jí)濃縮同位素稀釋劑(mYg)混合后用超純水稀釋到45 mL，兩種試劑的加入量均以實(shí)際稱得質(zhì)量計(jì)算。

鈣標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制：取0.15 mL二級(jí)鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋至45 mL。

濃縮同位素工作溶液配制：取1.0 mL二級(jí)濃縮同位素稀釋劑，用超純水稀釋至45 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 甲烷反應(yīng)氣流量的設(shè)定

質(zhì)譜法分析鈣元素時(shí)，氬氣干擾很嚴(yán)重，Elan DRC-e型儀器可以利用通入甲烷氣體消除氬氣的干擾，因?yàn)?2Ca比44Ca豐度小很多，所以氬氣對(duì)42Ca比對(duì)44Ca的相對(duì)干擾要嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)中以檢測(cè)42Ca確定甲烷與氬氣的最佳流速。利用儀器自帶的“反應(yīng)池碰撞氣體流量?jī)?yōu)化”模式，找到甲烷、氬氣的最佳流速分別為0.9，0.8 mL／min，經(jīng)驗(yàn)證在此條件下氬氣對(duì)44Ca 的干擾基本消除。

2.1.2 分析時(shí)間參數(shù)的設(shè)定

使用Boulyga［14］等反應(yīng)池模式測(cè)定44Ca／40Ca值時(shí)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，44Ca／42Ca值的重復(fù)性不能滿足定值要求。當(dāng)掃描次數(shù)、單次測(cè)量讀樣次數(shù)及重復(fù)次數(shù)均設(shè)置為25時(shí)，數(shù)據(jù)的重復(fù)性明顯優(yōu)于前者，此時(shí)的單次分析時(shí)間約為5 min。將sweeps，readings，replicates視為3個(gè)獨(dú)立的測(cè)量次數(shù)的參數(shù)，25∶25∶25的結(jié)果也符合不確定度計(jì)算公式。

2.1.3 硝酸濃度變化對(duì)44Ca／42Ca值的影響

配制硝酸底液濃度不同的1.00 μg／mL Ca溶液，在相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定44Ca／42Ca值，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，酸度變化時(shí)對(duì)同位素比值沒(méi)有明顯的影響，但cps響應(yīng)信號(hào)隨酸度的增加而減小。因此，在配制基準(zhǔn)溶液和樣品溶液時(shí)，不必考慮酸度的差異，為了使信號(hào)強(qiáng)度最大，對(duì)于血清樣本可直接進(jìn)行稀釋。

表1 硝酸含量對(duì)44Ca／42Ca值測(cè)定結(jié)果的影響

2.1.4 鈣濃度變化對(duì)44Ca／42Ca值的影響

綜上所述，骨關(guān)節(jié)結(jié)核在發(fā)生與發(fā)展的過(guò)程中，伴隨著機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化，IL-15、MCP-1和TGF-β含量顯著增高，提示其可能參與骨關(guān)節(jié)結(jié)核的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，但其具體機(jī)制尚未明確，有待深入研究。IL-15、MCP-1和TGF-β的表達(dá)水平有望成為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的預(yù)防、診斷、病情監(jiān)測(cè)及判斷預(yù)后的重要臨床參考指標(biāo)。

不同質(zhì)量濃度鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液44Ca／42Ca值的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，當(dāng)鈣質(zhì)量濃度為0.5～1.5 μg／mL時(shí)，測(cè)量結(jié)果穩(wěn)定性與重復(fù)性均很好；而當(dāng)鈣質(zhì)量濃度較低時(shí)，儀器的重復(fù)性和本底空白值明顯影響44Ca／42Ca值的重復(fù)性和穩(wěn)定性。因此血清樣本稀釋后的鈣質(zhì)量濃度在0.5～1.5 g／mL范圍時(shí)，測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性較好。

表2 不同濃度鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液44Ca／42Ca值的測(cè)定結(jié)果

2.1.5 程序的確定

為了保證基準(zhǔn)溶液濃度的準(zhǔn)確性，定值分析時(shí)二級(jí)以下的溶液均為當(dāng)天配制［15］。為了獲得同位素比測(cè)量的最佳精度，在樣品和同位素稀釋劑的混合試樣中使同位素比盡量接近于1［10］。在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中發(fā)現(xiàn)RZ和RY的波動(dòng)性對(duì)最終結(jié)果影響很小，而RB與RBC的測(cè)量波動(dòng)性對(duì)最終的結(jié)果是有影響的，因此RB與RBC必須交替測(cè)定，這樣可同時(shí)消除儀器的測(cè)量漂移引入的誤差。對(duì)于每份血清樣本獨(dú)立稀釋成3個(gè)混合試樣，每個(gè)混合試樣進(jìn)行6次獨(dú)立分析，取其均值。

樣品中鈣的質(zhì)量濃度根據(jù)式(1)計(jì)算［11］：

式中：cZ——鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度；

mY——血清樣品與濃縮同位素稀釋劑混合時(shí)濃縮同位素稀釋劑加入的質(zhì)量；

mX——血清樣品與濃縮同位素稀釋劑混合時(shí)血清樣品加入的質(zhì)量；

mZC——標(biāo)準(zhǔn)溶液與濃縮同位素稀釋劑混合時(shí)鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液加入的質(zhì)量；

Rz——鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液中44Ca／42Ca的同位素豐度比；

RY——濃縮同位素稀釋劑中44Ca／42Ca的豐度比；

RB— —血清樣品與濃縮同位素稀釋劑混合物中44Ca／42Ca的豐度比；

REC——鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液與濃縮同位素稀釋劑混合物中44Ca／42Ca的豐度比。

2.2 重復(fù)性

按照建立的定值方法對(duì)自制的leve1–3冷凍人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。表3中，前3個(gè)數(shù)據(jù)為第1天的定值結(jié)果，后3個(gè)數(shù)據(jù)為第2天的定值結(jié)果。

表3 3個(gè)水平人血樣本Ca含量的定值數(shù)據(jù)

2.3 準(zhǔn)確性

按照建立的定值方法對(duì)NIST 956c和GBW 09152人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的鈣進(jìn)行準(zhǔn)確度驗(yàn)證，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 NIST 956c和GBW 09152標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中Ca含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了在動(dòng)態(tài)反應(yīng)池模式的四級(jí)桿電感耦合等離子體質(zhì)譜儀上用同位素稀釋質(zhì)譜法定值血清中總鈣的參考方法，取得了滿意的定值結(jié)果。驗(yàn)證了兩步同位素稀釋質(zhì)譜法公式的實(shí)用效果。定值過(guò)程中減少了被測(cè)同位素的量，降低了對(duì)質(zhì)譜儀器的要求，定值結(jié)果準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，本法可以作為實(shí)驗(yàn)室測(cè)定血清中鈣的參考方法。

［1］吳金慶，葛廣禮，劉永梅.慢性腎臟病患者血清鈣、磷、hs-CRP、IL–6水平變化及其相關(guān)性分析［J］.山東醫(yī)藥，2014，27: 70–72.

［2］沈貴生.血清鈣和C反應(yīng)蛋白聯(lián)合檢測(cè)對(duì)急性胰腺炎危重度的早期預(yù)測(cè)價(jià)值［J］.肝膽外科雜志，2012，20(5): 352–354.

［3］李晴，高琳，王巍，等.維持性血液透析患者血清成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23水平與血清鈣、磷水平及左心室功能的關(guān)系研究［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2013，16(12): 4 173–4 175.

［4］尹梁宇，陰建，崔劍鋒，等.血清鈣離子水平與肝硬化發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究［J］.中華流行病學(xué)雜志，2013，34(5): 457–460.

［5］黎海東，曾麗雯，鄭丹，等.血清鈣濃度變化與妊娠期高血壓癥的相關(guān)性分析［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014，32(3): 287–288.

［6］趙華，李本濤，馮典英.電感耦合等離子體質(zhì)譜法痕量成分定值技術(shù)研究進(jìn)展［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2007，16(5): 77–79.

［7］王軍，韋超，郭燁，等.同位素稀釋電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)量血清中的鈣［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2007，28(增刊):78–80.

［8］馮流星，王軍.同位素稀釋–激光剝蝕–電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定生物組織樣品中鐵元素的含量［J］.分析化學(xué)，2014(4): 536–541.

［9］趙華，李本濤，馮典英，等.同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定高純金屬銦中的微量鎘［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2008，17(5): 13–15.

［10］JJF 1267–2010 同位素稀釋質(zhì)譜基準(zhǔn)方法［S］.

［11］Mike Sargent，Rita Harte，Chris Harrington. Guidelines for Achieving High Accuracy in Isotope Dilution Mass Spectrometry (IDMS)［R］. RSC Analytical Methods Committee，2002: 42–49.

［12］Nevel L Van，Aregbe Y，Taylor P D P. CCQM–K14 key comparison Calcium amount content in serum［J］. Metrologia，2004，41: 080 03.

［13］Lorna A Simpson，Ruth Hearn，et al. A comparison of doublefocusing sector fi eld ICP–MS，ICP–OES and octopole collision cell ICP–MS for the high-accuracy determination of calcium in human serum［J］. Talanta，2005，65 : 900–906.

［14］Sergei F Boulyga，Urs Klo1 tzli，Gerhard Stingeder. Optimization and application of ICPMS with dynamic reaction cell for precise determination of44Ca／40Ca isotope ratios［J］. Anal Chem，2007，79: 7 753–7 760.

［15］Karen E Murphy，Stephen E Long，Michael S Rearick，et al. The accurate determination of potassium and calcium using isotope dilution inductively coupled “cold” plasma mass spectrometry［J］.J Anal，2002，17: 469–477.