毛曉婷，金尚忠，周鵬威，李敏超，唐海濤

1(中國(guó)計(jì)量學(xué)院光學(xué)與電子科技學(xué)院，浙江杭州，310018)2(華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海，200237)

3(北京美拓琪科技有限公司，北京，100088)

紅外光譜檢測(cè)方法是一種常用的化學(xué)分析方法，無(wú)論是對(duì)于已知物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析，還是對(duì)未知物的鑒定，紅外分析方法都顯示出其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)［1］。同時(shí)，隨著近年來(lái)紅外技術(shù)及儀器的發(fā)展，傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR)以其高精度、高分辨率等優(yōu)勢(shì)逐漸替代光柵型的紅外光譜儀。相比于近紅外光譜檢測(cè)方法，紅外光譜不僅檢測(cè)速度快，而且吸收峰與成分含量關(guān)系直接、數(shù)據(jù)分析和建模簡(jiǎn)單［2］，檢測(cè)靈敏度和精度高，更適合于保健品、藥品等復(fù)雜成分合成的在線(xiàn)檢測(cè)［3］。配以衰減全內(nèi)反射(Attenuated Total Reflectance，ATR)探頭，使得對(duì)于一些先前難以測(cè)試的物質(zhì)(如紅外吸收過(guò)強(qiáng)的物質(zhì)、粉末、糊狀樣品、纖維、微量液體等)的檢測(cè)成為可能［1］。

本文提出了一種保健品合成過(guò)程中，甲醇和甘油在線(xiàn)紅外監(jiān)測(cè)方案。應(yīng)用FTIR光譜檢測(cè)技術(shù)結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析方法，對(duì)所得的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，并將其應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了反應(yīng)過(guò)程中甲醇和甘油物質(zhì)含量及變化趨勢(shì)，結(jié)果與實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中基本相符，甘油和甲醇從其加入反應(yīng)釜到完全耗盡分別用時(shí)約40 h和6 h，為工業(yè)上生物反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)物的過(guò)程檢測(cè)提供一種可行方法。

1 ATR紅外光譜分析原理

當(dāng)樣品受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時(shí)，分子吸收某些頻率的輻射，并由其振動(dòng)運(yùn)動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)引起偶極矩的變化，對(duì)于不同的分子結(jié)構(gòu)，所產(chǎn)生的化學(xué)鍵的伸縮振動(dòng)不同，從而出現(xiàn)明顯的吸收峰，因此根據(jù)甲醇和甘油特有的紅外吸收峰對(duì)其檢測(cè)。

中紅外光譜區(qū)吸收峰與成分含量關(guān)系直接。根據(jù)朗伯比爾(Lambert-Beer)定律［1］，當(dāng)一束光通過(guò)樣品時(shí)，任意波長(zhǎng)光的吸收強(qiáng)度(吸光度)與樣品中各組分的濃度成正比，與光程長(zhǎng)(樣品厚度)成正比。對(duì)于非吸收性溶劑中單一溶質(zhì)的紅外吸收光譜，在任一波數(shù)(υ，單位cm-1)處的吸光度為:

式中:A(υ)和T(υ)為波數(shù)υ處的紅外吸光度和透射率;α(υ)為υ處的吸收系數(shù);b為光程(樣品厚度，cm);c為樣品濃度(對(duì)液體物質(zhì)，mol/L)［1］。

對(duì)N個(gè)組分的混合樣品，在波數(shù)υ處的總吸光度為:

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中只要測(cè)得多個(gè)波數(shù)位置的紅外吸光度，通過(guò)已建立的紅外模型就能反演獲得相應(yīng)的參數(shù)測(cè)量。從式(1)中可見(jiàn)，物質(zhì)在各波數(shù)處的吸光度值不同，因此測(cè)試波段的選擇決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

一定量的畢赤酵母菌培養(yǎng)液、適量的畢赤酵母菌種，甘油和甲醇分別為1 000 g和250 g。在適合該酵母菌生長(zhǎng)的環(huán)境(由華東理工大學(xué)提供)下培養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)裝置

2.2.1 ATR附件工作原理

衰減全內(nèi)反射(ATR)光譜，以光輻射發(fā)生在2種介質(zhì)界面的全內(nèi)反射為基礎(chǔ)，如圖1所示。當(dāng)滿(mǎn)足條件:介質(zhì)1(晶體)的折射率n1大于介質(zhì)2的折射率n2，當(dāng)入射角θ大于臨界角θc(sinθc=n2/n1)時(shí)，發(fā)生全反射。紅外光在晶體內(nèi)表面發(fā)生全反射時(shí)，在晶體的外表面附近產(chǎn)生隱失波。當(dāng)樣品與晶體外表面接觸時(shí)，每個(gè)反射點(diǎn)隱失波都進(jìn)入樣品。從隱失波衰減的能量可以得到吸收信息。常用的ATR探頭分為2種，一種是在晶體內(nèi)部發(fā)生多次全內(nèi)反射，另一種是單次全內(nèi)反射ATR。多次全內(nèi)反射ATR探頭靈敏度高，價(jià)格貴，體積大，對(duì)于紅外吸收較強(qiáng)的物質(zhì)易引起飽和，本次實(shí)驗(yàn)為防止出現(xiàn)紅外吸收過(guò)飽和現(xiàn)象，采用單次反射ATR探頭［5］。

圖1 ATR工作原理示意圖Fig.1 The scheme of the attenuated total reflection(ATR)

2.2.2 光纖連接裝置

紅外光譜檢測(cè)用特殊的硫化物紅外光纖(如圖2所示)來(lái)實(shí)現(xiàn)光譜儀器與反應(yīng)釜的連接，硫化物對(duì)于紅外吸收區(qū)吸收較弱，同時(shí)由于光纖特有的柔軟性，使其與常見(jiàn)的光導(dǎo)管相比有更高的可操作性，外界的微震動(dòng)或彎曲不會(huì)造成過(guò)高的實(shí)驗(yàn)誤差，更適用于工業(yè)環(huán)境的實(shí)時(shí)檢測(cè)［6］。

圖2 光纖連接裝置實(shí)物圖Fig.2 Fiber optic connection device object

2.2.3 FTIR工作原理

FTIR光譜儀由3部分組成:紅外光源、干涉儀和探測(cè)器，其中干涉儀是最主要部分［7］。FTIR光譜儀工作時(shí)，從光源發(fā)出連續(xù)的紅外輻射經(jīng)分束器后被分為相等的兩束光，其中一束經(jīng)透射后到達(dá)動(dòng)鏡M3，另一束經(jīng)反射到達(dá)定鏡M2。兩束光分別經(jīng)定鏡和動(dòng)鏡反射再回到分束器發(fā)生干涉。由于動(dòng)鏡以恒定速度作直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)，因而產(chǎn)生的干涉圖是關(guān)于光程差的函數(shù)。通過(guò)樣品池含有樣品光信息的干涉光到達(dá)檢測(cè)器，檢測(cè)器測(cè)得的隨時(shí)間的信號(hào)，經(jīng)信號(hào)處理，通過(guò)傅里葉變換獲得隨波數(shù)(波長(zhǎng))的信號(hào)，最終得到透過(guò)率或吸光度隨波數(shù)(波長(zhǎng))的紅外吸收光譜圖［8］。相比于色散型的光譜儀，F(xiàn)TIR有更高的分辨率和靈敏度。

圖3 FTIR工作原理Fig.3 The scheme of FTIR spectrometer

2.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器

本實(shí)驗(yàn)選用BRUKER FTIR(TENSOR27)光譜儀，分辨率為4 cm-1，波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，維持恒定的環(huán)境溫度和濕度，每個(gè)樣品掃描140次共1 min。光譜數(shù)據(jù)由相應(yīng)的OPUS軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)裝置如圖4所示。

圖4 在線(xiàn)FT-IR監(jiān)測(cè)酵母菌發(fā)酵裝置圖Fig.4 System for the on-line FT-IR monitoring of yeast fermentation

光源發(fā)出紅外光通過(guò)光纖輸入端，入射到紅外ATR探頭，ATR探頭與反應(yīng)釜密封相連。經(jīng)ATR探頭反射的紅外光通過(guò)光纖的輸出端進(jìn)入碲鎘汞(MCT)探測(cè)器，探測(cè)器輸出的信號(hào)經(jīng)前置放大器、A/D變換，輸入到計(jì)算機(jī)，經(jīng)傅立葉變換得到紅外吸收光譜，通過(guò)OPUS軟件分析，從而獲得甘油(甲醇)的含量。值得注意的是，在實(shí)驗(yàn)初期需要調(diào)整ATR附件反射鏡的角度，使其輸出到檢測(cè)器的能量達(dá)到最大，盡量減小損失，提高性噪比。

3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

為實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)，本實(shí)驗(yàn)借助外部光纖連接器件，將光譜儀與反應(yīng)釜相連，改變傳統(tǒng)離線(xiàn)檢測(cè)方法。光纖連接器件采用專(zhuān)用的紅外傳輸光纖，相比于光導(dǎo)管，其柔韌性好，在工業(yè)應(yīng)用中能夠在一定程度上減小外界震動(dòng)引起光路變化損失的光強(qiáng)。在酵母菌培養(yǎng)過(guò)程中，甘油作為其發(fā)酵過(guò)程碳源，實(shí)時(shí)監(jiān)控甘油含量的變化，及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料顯得尤為重要。同時(shí)在甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的過(guò)程中，過(guò)高的甲醇含量會(huì)影響酵母菌的生長(zhǎng)。所以，準(zhǔn)確、快速監(jiān)測(cè)反應(yīng)釜中甘油和甲醇含量，對(duì)于保證酵母菌較好的生長(zhǎng)發(fā)揮重要的作用。

常用的兩種紅外光譜定量分析方法:一是測(cè)量吸收峰的峰高，另一種是測(cè)量吸收峰的峰面積。采用峰面積進(jìn)行定量分析往往比采用峰高進(jìn)行定量分析更加準(zhǔn)確［7］。而在進(jìn)行定量分析時(shí)，必須從測(cè)定的光譜中找出特征峰，求其峰面積從而進(jìn)行定量分析［9］。

對(duì)于不同的培養(yǎng)基，甘油和甲醇的紅外吸收峰會(huì)發(fā)生微弱的變化，即使是相同的基底，在不同的濃度情況下紅外吸收峰也會(huì)不同(圖5)。

通過(guò)測(cè)量不同濃度情況下甘油和甲醇的畢赤酵母菌溶液，選擇出最合適的甘油和甲醇紅外積分區(qū)域1 060～1 025 cm-1和1 027～1 007 cm-1。從圖5中可以看出，對(duì)于不同濃度的甘油和甲醇酵母菌溶液，隨著濃度的增大，吸光度逐漸增加。

在過(guò)程檢測(cè)中，將某一時(shí)刻多次光譜掃描數(shù)據(jù)的均值作為該時(shí)刻甘油(甲醇)的預(yù)測(cè)值，然而在實(shí)際監(jiān)測(cè)過(guò)程中，可能由于反應(yīng)釜攪拌棒的高速轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生氣泡，使得某次掃描紅外ATR探頭并未與反應(yīng)物完全接觸，而是處于氣泡之中，這樣在所得的數(shù)據(jù)中會(huì)存在異常值。在建模初期應(yīng)用格拉布斯統(tǒng)計(jì)方法剔除異常值，從而進(jìn)行后續(xù)處理。為了檢驗(yàn)所建模型在本次試驗(yàn)條件下的準(zhǔn)確度，首先用PLS建立的紅外模型對(duì)不同濃度下的甘油和甲醇酵母菌溶液進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖6所示。

從圖6中可以看出，甘油和甲醇的紅外模型的預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.985和0.998 7。

圖5 不同濃度的甘油(a)和甲醇(b)酵母菌溶液Fig.5 Different concentrations of glycerol and methanol solution of yeast

圖6 甘油(a)和甲醇(b)相關(guān)性特性曲線(xiàn)Fig.6 Glycerol and methanol correlation characteristic curve

目前作為一種離線(xiàn)檢測(cè)技術(shù)，F(xiàn)TIR光譜檢測(cè)得到廣泛的應(yīng)用，大多應(yīng)用在生物發(fā)酵過(guò)程中對(duì)光密度、生物量和各種反應(yīng)物以及中間產(chǎn)物的監(jiān)測(cè)［4，6，10-14］。但是國(guó)內(nèi)對(duì)于紅外在線(xiàn)的過(guò)程監(jiān)測(cè)，相關(guān)的研究文獻(xiàn)較少，還未成功的應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用BRUKER FTIR(TENSOR27)光譜儀外加紅外ATR附件對(duì)酵母菌培養(yǎng)過(guò)程中甘油和甲醇在線(xiàn)含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

實(shí)驗(yàn)條件:反應(yīng)釜中攪拌速率200 r/min，通氣流量20 L/min，壓力約0.3個(gè)大氣壓。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。隨著時(shí)間的增加，甘油含量從最初4%逐漸下降到1.2%，之后趨于穩(wěn)定，這是因?yàn)殡S著甘油含量的降低，其紅外吸收隨之減弱，超出儀器所能探測(cè)到的范圍。相比于離線(xiàn)紅外檢測(cè)的甘油檢出限1%，儀器在線(xiàn)監(jiān)測(cè)靈敏度相對(duì)較弱。在甘油完全耗盡之后，向反應(yīng)釜中加入甲醇溶液刺激酵母菌的生長(zhǎng)，圖7-b中，甲醇含量逐漸降低直至0.7%左右，同樣相比于離線(xiàn)甲醇檢測(cè)的檢出限0.5%，在線(xiàn)甲醇檢測(cè)的靈敏度低。同時(shí)在單位時(shí)間內(nèi)甘油和甲醇的含量變化分別為0.107%和0.226%。

圖7 甘油(a)和甲醇(b)含量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.7 Glycerol and methanol concentration varying trend with time going

圖7中，甲醇和甘油的含量并不是完全嚴(yán)格的線(xiàn)性減少，在某一測(cè)試點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)數(shù)據(jù)陡然增大或減小。圖中實(shí)線(xiàn)為不同測(cè)試時(shí)刻多次測(cè)量的平均值，由于多次測(cè)量所處的反應(yīng)狀態(tài)不同，會(huì)出現(xiàn)一定的誤差，但是從總體趨勢(shì)看，隨著時(shí)間的推移，甘油和甲醇的含量呈下降趨勢(shì)。除此之外，當(dāng)甘油(甲醇)濃度過(guò)低時(shí)，將無(wú)法準(zhǔn)確的檢出。目前，甘油和甲醇的離線(xiàn)檢出限分別為1%和0.5%，在線(xiàn)檢出限分別為1.2%和0.7%，更低濃度的測(cè)量結(jié)果不穩(wěn)定，有待提高。相比于高轉(zhuǎn)速(500 r/min)、短的掃描時(shí)間情況下，在低轉(zhuǎn)速(200 r/min)、掃描時(shí)間較長(zhǎng)的條件下所測(cè)得的數(shù)據(jù)較穩(wěn)定［15］。

雖然在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于釜體的振動(dòng)，或通氣過(guò)程中釜體中氣泡的產(chǎn)生，以及其他因素的影響會(huì)引起數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)不穩(wěn)定。但從甘油和甲醇含量總體趨勢(shì)的變化，充分相信ATR-FTIR能夠用于過(guò)程監(jiān)測(cè)的可能性。

4 結(jié)論

紅外光譜分析技術(shù)，作為一種快速、無(wú)損檢測(cè)技術(shù)逐漸得到研究人員的關(guān)注［9］。在對(duì)酵母菌培養(yǎng)的過(guò)程中，應(yīng)用ATR-FTIR對(duì)甘油和甲醇進(jìn)行在線(xiàn)監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:應(yīng)用紅外光譜分析技術(shù)能夠成功的監(jiān)測(cè)畢赤酵母菌生長(zhǎng)過(guò)程中甘油(甲醇)含量的變化情況，甘油和甲醇紅外模型相關(guān)度分別為0.985和0.998 7;培養(yǎng)開(kāi)始40 h之后甘油耗盡，加入甲醇6 h之后其含量幾乎為0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明，紅外光譜分析技術(shù)在工業(yè)制藥行業(yè)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)物質(zhì)含量變化的可行性。同時(shí)，隨著紅外光譜儀器的快速發(fā)展，數(shù)據(jù)分析技術(shù)的提升，相信紅外光譜檢測(cè)技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程控制中將發(fā)揮重要作用［14］。

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