張培文，趙 雪，何 玲，巫小倩，張順華，朱 礪

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川雅安 625014）

四川省引進(jìn)外種豬群體的ESR基因PvuⅡ位點(diǎn)多態(tài)性分析

張培文，趙 雪，何 玲，巫小倩，張順華，朱 礪*1

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川雅安 625014）

采用PCR-RFLPs方法，對(duì)四川引進(jìn)外種豬（杜洛克、長白豬和約克夏）ESR基因的多態(tài)性進(jìn)行研究。并對(duì)ESR基因的基因頻率和基因型頻率進(jìn)行分析，結(jié)果表明：杜洛克出現(xiàn)了AA、AB、BB3種基因型，基因型頻率分別為76.32%、18.42%和5.26%，A、B基因頻率分別為85.53%和14.47%；長白豬中僅出現(xiàn)AA和AB2種基因型，且基因型頻率分別為67.74%和32.26%，其中，等位基因A、B頻率分別為83.87%和16.13%；在約克夏中存在AA、AB、BB3種基因型，頻率分別為22.22%、61.90%和15.87%，等位基因A與等位基因B頻率相當(dāng)，分別為53.18%和46.82%。

杜洛克；長白豬；約克夏；ESR基因；PCR-RFLP

0 引言

豬是世界上最重要的肉用動(dòng)物之一，而中國既是養(yǎng)豬大國，也是豬肉消費(fèi)大國。但在我國養(yǎng)豬業(yè)中，處于繁育體系“金字塔”頂端的核心種質(zhì)群一直處于較為薄弱的狀態(tài)，對(duì)引種的依賴性較強(qiáng)。為了擺脫“引種-退化-再引種”的不良循環(huán)，我們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)引進(jìn)種豬的再一次選育[1]。

豬的產(chǎn)仔數(shù)是極其重要的經(jīng)濟(jì)性狀，提高母豬產(chǎn)仔數(shù)可增加商品肉豬的產(chǎn)量，給現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)帶來非常大的經(jīng)濟(jì)效益。目前，關(guān)于豬產(chǎn)仔數(shù)的研究中，報(bào)道了大量的主基因，如雌激素受體(ESR)基因、催乳素受體(PRLR)基因、卵泡促激素β亞基(FSHβ)基因、備解素(OPN)基因等。ESR基因是影響繁殖性能的重要功能基因，且該基因在國內(nèi)外被廣泛研究，并運(yùn)用于后備種豬的標(biāo)記輔助選擇（MAS）[2-4]。

1994年， 美 國Iowa大 學(xué) 的Rothschild等[5-7]發(fā)現(xiàn)了豬雌激素受體基因（Estrogen receptor gene， ESR），并確定其是產(chǎn)仔數(shù)性狀的主效基因或者是與產(chǎn)仔數(shù)主效基因緊密連鎖的基因，并且找到了將ESR基因酶切為AA、AB、BB3種基因型的多態(tài)性位點(diǎn)PvuⅡ，研究發(fā)現(xiàn)，BB為優(yōu)勢基因型，且不同基因型的繁殖性能表現(xiàn)為BB＞AB＞AA的趨勢；等位基因B為優(yōu)勢基因。在此之后，大量的對(duì)不同豬種的研究得出了相同結(jié)論，盡管所研究的這些豬種存在著不同的遺傳背景[8-9]。本次試驗(yàn)以319頭種豬（包括杜洛克38頭、長白豬155頭，約克夏126頭）的耳組織為樣本，提取耳組織中的DNA，采用PCR-RFLP分型技術(shù)對(duì)ESR基因進(jìn)行檢測，從而分析引進(jìn)種豬的ESR基因分布情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來自四川某豬育種公司核心育種場新引進(jìn)的種豬耳組織樣品（包括杜洛克38頭、長白豬155頭、約克夏126頭）。-20 ℃下75%酒精保存，用于基因組DNA制備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

取火柴頭大小的豬耳組織樣品，放于75%的酒精中洗凈，在1.5 mL的離心管中剪碎，利用TIANGEN DNA提取試劑盒提取DNA，按照試劑盒步驟操作。獲取的DNA樣品放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

引物合成。PCR引物序列參照文獻(xiàn)[7]，引物由華大基因合成：

Forward primer：5’-CCTGTTT TTACAGTGACTTTTACAGAG-3’

Reverse primer：5’-CACTTCGA GGGTCAGTCCAATTAG -3’

ESR基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25μL，其中TIANGEN 2×PreMasterMix 12.5μL；上游引物1μL；下游引物1μL；DNA模板2μL；DEPC水8.5μL。ESR基 因反應(yīng)條件：第1步94℃預(yù)變性3min，第2步94℃變性30 s，第3步退火60 ℃ 30 s，第4步72 ℃延伸5 min，重復(fù)第2步到第4步35個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸5 min，于12 ℃保存。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外檢測儀檢測照相并分析。

1.2.3 PvuⅡ酶切與電泳檢測

利用PvuⅡ酶對(duì)反應(yīng)所得120bpESR基因進(jìn)行酶切，整個(gè)反應(yīng)體系為15μL，包括酶切反應(yīng)緩沖液buffer1.5μL；擴(kuò)增產(chǎn)物溶液10μL；限制性內(nèi)切酶PvuⅡ0.5μL；加DEPC水至15.0μL。將混合液于37℃條件下水浴過夜（8 h以上）。將酶切后產(chǎn)物利用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈檢測儀檢測照相并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ESR的PCR擴(kuò)增

抽取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因的目的片段，所得片段大小120 bp（圖1）。圖譜上觀測無彌散和拖尾現(xiàn)象，表明擴(kuò)增目的條帶效果良好，與期望結(jié)果一致。

2.2 ESR基因的酶切電泳分析

通過限制性內(nèi)切酶PvuⅡ酶切，可能出現(xiàn)3種結(jié)果，分別為AA（120bp/120bp）、AB基 因 型（120bp/65bp、55bp）和BB基因型（ 65bp、55bp/65bp、55bp）。本試驗(yàn)中，杜洛克（見圖2）、約克夏（見圖4）均出現(xiàn)了AA、AB、BB 3種基因型、而長白豬（見圖3）僅出現(xiàn)了AA、AB 2種基因型。（本次試驗(yàn)中，由于所用瓊脂糖濃度較低，且電泳時(shí)間較短，導(dǎo)致55bp與65bp片段未分開）

2.3 ESR基因的群體遺傳特性分析

對(duì)杜洛克、長白豬、約克夏種豬的ESR基因利用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行基因分型，根據(jù)文獻(xiàn)中基因分型的判定標(biāo)準(zhǔn)[6]，3個(gè)豬種ESR基因的基因型分布以及群體遺傳特性分析結(jié)果見表1?？倶颖竞?19頭，包括杜洛克38頭、長白豬155頭，約克夏126頭。

圖1 ESR基因PCR產(chǎn)物電泳的結(jié)果

圖2 杜洛克ESR基因PCR-RFLPs 3%瓊脂糖凝膠電泳

圖3 長白豬ESR基因PCR-RFLPs 3%瓊脂糖凝膠電泳

圖4 約克夏ESR基因PCR-RFLPs 3%瓊脂糖凝膠電泳

由表1可知，杜洛克出現(xiàn)3種基因型，其中AA基因型頻率最高，為76.32%，其次為AB型，基因型頻率為18.42%，BB基因型僅為5.26%；且其A等位基因頻率高達(dá)85.53%。長白豬中，僅出現(xiàn)AA和AB 2種基因型，且AA基因型頻率為67.74%，AB基因型為32.26%；其中等位基因A的頻率為83.87%，等位基因B的頻率為16.13%。在約克夏中，基因型頻率最高的為AB基因型，頻率為61.90%，緊接著為AA基因型，為22.22%，最低的為BB基因型，頻率為15.87%，在約克夏中，等位基因A與等位基因B頻率相當(dāng)，分別為53.18%和46.82%。

表1 ESR基因的基因頻率和基因型頻率的分布

3 討論

本次試驗(yàn)所測得杜洛克等位基因B的頻率為14.47%，比田勇等[10]研究的47.06%低，而李鳳娥等[11]2000年試驗(yàn)得出杜洛克B基因的頻率為0。在對(duì)長白豬的研究中，本次試驗(yàn)所得B基因頻率為16.13%，之前有大量關(guān)于長白豬的研究中分別得出其等位基因B頻率為7.69%、19%、10%等[12]。對(duì)約克夏的研究中，張淑君等[13]報(bào)道了其B基因頻率為47.06%，后來田勇等[10]研究得出了相同結(jié)果，而本試驗(yàn)中，所得B等位基因頻率為46.82%，比前人研究略低。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是試驗(yàn)豬群以及樣本大小存在差異等。

ESR基因是影響豬繁殖性能的主效基因，是目前為止選擇產(chǎn)仔數(shù)最好的標(biāo)記。據(jù)前人研究得出豬產(chǎn)仔數(shù)與ESR基因型之間有BB＞AB＞AA的趨勢[5-7]。劉建華等[14]對(duì)杜洛克、長白豬和約克夏ESR基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)ESR基因?qū)ωi頭胎產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響，BB和AA純合子頭胎總產(chǎn)仔數(shù)與活產(chǎn)仔數(shù)分別相差3.361和1.1913，每個(gè)等位基因B的加性效應(yīng)分別是1.680和0.597。田勇等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在杜洛克中，初產(chǎn)胎次B基因的加性效應(yīng)為3.56和2.10，在經(jīng)產(chǎn)胎次中B基因的加性效應(yīng)為1.90和1.38；在長白豬中，初產(chǎn)胎次B基因的加性效應(yīng)為2.70和1.25，在經(jīng)產(chǎn)胎次中B基因的加性效應(yīng)為1.62和2.24；在杜洛克中，初產(chǎn)胎次B基因的加性效應(yīng)為2.29和1.92，在經(jīng)產(chǎn)胎次中B基因的加性效應(yīng)為0.76和1.15。

在本試驗(yàn)中，在杜洛克、長白以及約克夏3個(gè)豬種中BB基因型頻率均低，分別為5.26%、0、15.87%；且在杜洛克與長白豬中，AA基因型頻率均大于60%；而在約克夏中AB基因型為主要基因型，占到61.90%。通過以上數(shù)據(jù)，我們可以對(duì)引進(jìn)的這一批種豬的繁殖性能有一個(gè)大概的了解。我們應(yīng)綜合種豬的其他性狀，并對(duì)ESR基因的優(yōu)勢等位基因B進(jìn)行保留，對(duì)引進(jìn)的種豬進(jìn)行再一次選育。豬的繁殖性狀屬于低遺傳力性狀，非遺傳效應(yīng)對(duì)其影響較大。因此，除了堅(jiān)持遺傳標(biāo)記輔助選擇外，還需要注意為種豬提供較好的營養(yǎng)、防疫及飼養(yǎng)環(huán)境等其他綜合的非遺傳條件，以確保種豬的最佳繁殖性能。

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2014-02-09)

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013BAD20B07），四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013NZ0041），科技部和四川省科技富民強(qiáng)縣項(xiàng)目資助

朱礪，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：豬的遺傳育種