朱誠(chéng)棋，周 樂(lè)，蘇 秀

山核桃內(nèi)生真菌對(duì)山核桃干腐病抑制作用初步研究

朱誠(chéng)棋，周 樂(lè)，蘇 秀*

（浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安，311300）

采用PDA培養(yǎng)基分離了不同感病等級(jí)山核桃（Carya cathayensis）樹(shù)組織中的內(nèi)生真菌，共得到28種內(nèi)生真菌，用兩點(diǎn)對(duì)峙法測(cè)定這28種內(nèi)生真菌對(duì)山核桃干腐?。–anker disease of Carya cathayensis）的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果表明：有3株內(nèi)生真菌（編號(hào)分別為X-5、X-7和H-3）對(duì)山核桃干腐病有明顯抑制作用；在對(duì)峙培養(yǎng)的72 h內(nèi)，X-5對(duì)山核桃干腐病的抑制作用分別為45.32%、34.98%、28.61%，X-7抑制作用分別為10.73%、23.03%、12.01%，H-3抑制作用分別為49.72%、44.30%、32.03%；其余內(nèi)生真菌對(duì)山核桃干腐病均無(wú)抑制作用或在對(duì)峙培養(yǎng)的后期出現(xiàn)比較弱的抑制作用。

山核桃干腐??；內(nèi)生真菌；生物防治

山核桃（Carya cathayensis）為胡桃科（Juglandaceae）山核桃屬（Carya）落葉喬木，主要分布在浙、皖交界的天目山區(qū)、昌北區(qū)，為我國(guó)特有的著名干果和木本油料樹(shù)種，是集生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益為一體的生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[1]。近年來(lái)，山核桃干腐病發(fā)生非常嚴(yán)重，在主產(chǎn)區(qū)臨安、淳安、桐廬、寧國(guó)，株發(fā)病率高達(dá)80%～100%，病株上少則幾個(gè)病斑，多則幾十個(gè)病斑，最嚴(yán)重的可達(dá)數(shù)百個(gè)病斑，造成枝枯或株枯，嚴(yán)重影響了山核桃林生長(zhǎng)發(fā)育和山核桃品質(zhì)[2]。目前，山核桃干腐病的防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥噴灑法和物理刮除病斑法[3～5]。直接刮除病斑會(huì)人為造成樹(shù)體新的傷口，易再度引發(fā)病菌侵入，且防治效果不持久，生產(chǎn)上不提倡使用；適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)防治對(duì)于控制山核桃干腐病非常必要[6～8]，但是從長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮，山核桃是一種高檔干果，對(duì)食品安全性要求很高，應(yīng)選擇生物防治的方法。利用植物內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物防治病蟲(chóng)害是生物防治的一個(gè)重要方向，是目前研究的熱點(diǎn)之一[9]，但山核桃內(nèi)生真菌資源及其生物防治作用尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本文初步研究了山核桃內(nèi)生真菌對(duì)山核桃干腐病的抑制作用，為山核桃干腐病的生物防治方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣地自然概況 山核桃組織樣品采自浙江省臨安市橫路鎮(zhèn)和安徽省寧國(guó)市仙霞鎮(zhèn)。

橫路樣地GPS定位：30° 20′ 02.3″ N，119° 18′ 16.5″ E，精度3 m，海拔256 m，坡度45°，坡向東南，周?chē)h(huán)境為純林，有少量松樹(shù)、竹子并有紅薯間作，樹(shù)齡為15～20 a。

仙霞樣地GPS定位：30° 24′ 48.7″ N，119° 16′ 29.9″ E，精度4 m，海拔175 m，坡度40°，坡向西，周?chē)h(huán)境為純林，周?chē)忻瘛⒗字?，?shù)齡為25～30 a。

1.1.2 試驗(yàn)材料與儀器 山核桃干腐病病原菌茶藨子葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）由浙江農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供[10]。山核桃樹(shù)干和枝條組織采自以上兩個(gè)樣地，采集時(shí)間是2012年4月12日上午。試驗(yàn)試劑主要有5%的NaClO溶液、75%的乙醇溶液等。儀器主要有三洋超凈工作臺(tái)MCV-B131F（T）、三洋全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3750、MfⅡ全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀、電子天平BS-224S、電熱恒溫水浴鍋、生化培養(yǎng)箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 在每個(gè)樣地用無(wú)菌剪刀和刮皮刀分別采集健康的枝條、樹(shù)干（樹(shù)皮），感病的枝條、樹(shù)干（樹(shù)皮）和感病嚴(yán)重的枝條若干，分別裝入滅菌紙袋內(nèi)并進(jìn)行編號(hào)。感病等級(jí)根據(jù)樹(shù)干或枝條上的病斑數(shù)量判斷，病斑數(shù)量≤10個(gè)，且樹(shù)木長(zhǎng)勢(shì)正常的為“感病”的；病斑數(shù)≥15，樹(shù)木長(zhǎng)勢(shì)弱的為“感病嚴(yán)重”的。

1.2.2 內(nèi)生真菌的分離

1.2.2.1 山核桃枝條內(nèi)生真菌的分離方法 將山核桃枝段組織切成段，混合后隨機(jī)取10支，先用清水洗凈，然后將枝段切成長(zhǎng)1.0～1.5 cm的短段，再進(jìn)行表面消毒：用5%次氯酸鈉液處理5 min，無(wú)菌水沖洗，75%酒精處理2 min，無(wú)菌水沖洗，無(wú)菌吸水紙吸干，75%酒精處理1 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，最后用無(wú)菌吸水紙吸去表面水，取最后1次無(wú)菌水洗液涂于三塊平板上培養(yǎng)，在恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)3～4d，觀察有無(wú)菌落產(chǎn)生，若發(fā)現(xiàn)皿中無(wú)菌落生成，則證明該材料表面消毒徹底，否則，不能使用。隨機(jī)選取組織塊接入PDA平板培養(yǎng)基上，每皿接3塊，每樣接3皿，將培養(yǎng)皿放在28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。依據(jù)菌落形態(tài)特征，依據(jù)參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行鑒定。

1.2.2.2 山核桃樹(shù)干（樹(shù)皮）內(nèi)生真菌的分離方法 將山核桃樹(shù)干組織切成塊，混合后隨機(jī)取10塊，先用清水洗凈，然后將樹(shù)干組織分割為0.5 cm×0.5 cm的組織塊。表面消毒方法同上，將消毒后的干皮組織縱剖為4～6份，隨機(jī)選取接入PDA平板培養(yǎng)基上，每皿接3塊，每樣接3皿，將培養(yǎng)皿放在28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。依據(jù)菌落形態(tài)特征，依據(jù)參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行鑒定。

1.2.3 山核桃內(nèi)生真菌對(duì)山核桃干腐病的抑制作用 采用對(duì)峙培養(yǎng)法研究山核桃內(nèi)生真菌與干腐病之間的相互關(guān)系。選取幾種優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌活化培養(yǎng)5 d后，取直徑為0.5 cm內(nèi)生真菌和山核桃干腐病病原菌的菌絲塊接種于PDA平板上距中心2 cm處同一直線(xiàn)的兩點(diǎn)上，同時(shí)設(shè)接種病原菌為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，于25℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察抑菌作用。病原菌與拮抗菌落相交之后，觀察記錄拮抗菌對(duì)病原菌的包圍、抑制、寄生及侵入病菌菌落，占領(lǐng)其營(yíng)養(yǎng)空間的過(guò)程，挑取相交界面處的菌絲鏡檢觀察，并且每日用MfⅡ全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀測(cè)量?jī)?nèi)生真菌的菌落直徑、病原菌的菌落直徑以及只接病原菌的對(duì)照直徑比較。按以下公式計(jì)算病菌的生長(zhǎng)抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，前期對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行了內(nèi)生真菌的分離及培養(yǎng)，其中仙霞樣品分離出了13種內(nèi)生真菌，橫路樣品分離出了15種內(nèi)生真菌。從兩地分離到的內(nèi)生真菌編號(hào)如表1。

從表1可以看出，山核桃內(nèi)生真菌的種類(lèi)在感病與不感病植株以及同一植株的不同部位呈現(xiàn)一定的差異性，感病樹(shù)干（枝條）上的內(nèi)生真菌數(shù)相對(duì)要高一些；橫路采集到的樣品中內(nèi)生真菌數(shù)量比仙霞樣品稍多。

表1 仙霞和橫路樣地分離到的內(nèi)生真菌Table 1 Fungal endophytes isolated from hickory collected in Zhejiang and Anhui

2.2 兩點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果

采用兩點(diǎn)對(duì)峙法測(cè)定了上述內(nèi)生真菌對(duì)山核桃干腐病的生長(zhǎng)抑制作用。其中，仙霞樣品中X-1、X-2、X-4、X-6、X-8、X-10這6種內(nèi)生真菌以及橫路樣品中H-1、H-2、H-7、H-9這4種內(nèi)生真菌在對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中明顯比山核桃干腐病病原菌生長(zhǎng)慢，對(duì)病原菌無(wú)抑制作用，故不予進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)及分析。其余內(nèi)生真菌的對(duì)峙培養(yǎng)中，山核桃干腐病病原菌的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。

表2 對(duì)峙培養(yǎng)中山核桃干腐病病原菌直徑Table 2 Diameter of B. dothidea during face-to-face culture

由表2可知，仙霞樣品中X-5、X-7在72 h內(nèi)均對(duì)山核桃干腐病病原菌有抑制作用；橫路樣品中H-3在72 h內(nèi)對(duì)山核桃干腐病有明顯抑制作用，而H-6、H-10、H-11的生長(zhǎng)速度與山核桃干腐病差不多，其余內(nèi)生真菌對(duì)山核桃干腐病均無(wú)抑制作用。

2.3 內(nèi)生真菌對(duì)山核桃干腐病菌的生長(zhǎng)抑制作用

病菌生長(zhǎng)抑制率，見(jiàn)表3。

表3 內(nèi)生真菌山核桃干腐病病菌的生長(zhǎng)抑制效果Table 4 Inhibitive effect of isolated endophytes agaist B. dothidea

由表3可知，仙霞樣品中X-5對(duì)山核桃干腐病的抑制作用分別為45.32%、34.98%、28.61%，X-7對(duì)山核桃干腐病的抑制作用分別為10.73%、23.03%、12.01%；橫路樣品中H-3對(duì)山核桃干腐病的抑制作用分別為49.72%、44.30%、32.03%，H-10、H-6、H-11在對(duì)峙培養(yǎng)的后期出現(xiàn)比較弱的抑制作用。

3 討論

本研究對(duì)山核桃主產(chǎn)地臨安和寧國(guó)的兩個(gè)山核桃干腐病高發(fā)區(qū)不同感病等級(jí)的山核桃樹(shù)組織中內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，研究發(fā)現(xiàn)，感病山核桃枝條、樹(shù)干的內(nèi)生真菌種類(lèi)略大于健康山核桃植株中的內(nèi)生真菌數(shù)量。但這一結(jié)果可能具有隨機(jī)性，因?yàn)楸驹囼?yàn)在山核桃內(nèi)生真菌的分離過(guò)程中，僅采用了一種PDA培養(yǎng)基去分離培養(yǎng)山核桃內(nèi)生真菌，這就導(dǎo)致不能在 PDA培養(yǎng)基上很好的真菌無(wú)法分離到；同時(shí)，5%次氯酸鈉液處理材料時(shí)間的長(zhǎng)短以及溫度，濕度等都有可能影響內(nèi)生真菌的分離率。因此，多季節(jié)、多地點(diǎn)、多植株采樣、多種方式純化分離有助于得到更多抑制作用明顯的山核桃內(nèi)生真菌。

本研究采用兩點(diǎn)對(duì)峙法測(cè)定了山核桃內(nèi)生真菌對(duì)山核桃干腐病的生長(zhǎng)抑制作用，發(fā)現(xiàn)有3種內(nèi)生真菌對(duì)山核桃干腐病有明顯抑制作用。這是首次報(bào)道山核桃內(nèi)生真菌資源及其生物防治作用，為探索山核桃干腐病的生物防治方法提供了理論依據(jù)。這3種內(nèi)生真菌具體的分類(lèi)地位、對(duì)山核桃干腐病起抑制作用的活性物質(zhì)及抑制作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Preliminary Research on Fungal endophytes Inhibition of Canker Disease of Carya cathayensis

ZHU Cheng-qi，ZHOU Le，SU Xiu*
（School of Forestry & Biotechnolog, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）

PDA medium was used for isolating fungal endophytes from different diseased organs of hickory (Carya cathayensis) collected from Lin’an of Zhejiang and Ningguo of Anhui province on April 12, 2014. Total of 28 strains fungal endophytes were isolated. Determinations of inhibition of isolated endophytes against canker disease (Botryosphaeria dothidea) were conducted by face-to-face culturing on PDA medium. The result demonstrated that 3 strains of endophytes (numbered X-5, X-7 and H-3) had significant inhibition effect against B. dothidea. In the first three days of culturing, the inhibition rate of X-5 was 45.32%, 34.98%, 28.61% per day, that of X-7 was 10.73%, 23.03%, 12.01% per day, and that of H-3 was 49.72%, 44.30%, 32.03%.

canker disease of Carya cathayensis; fungal endophytes; biological control

S763.15

B

1001-3776（2015）02-0058-04

2014-06-06；

2015-01-25

浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金項(xiàng)目（2013FK019）；浙江農(nóng)林大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201302013）

朱誠(chéng)棋（1992-），男，浙江桐鄉(xiāng)人，從事森林保護(hù)學(xué)研究；*通訊作者。