胃癌中Notch1、DLL4和HES1的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

·論著·

胃癌中Notch1、DLL4和HES1的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

何黎黎張富花張錦華莊劍波張建剛韓儉

摘要：目的通過檢測(cè)Notch信號(hào)系統(tǒng)中的Notch1、DLL4和HES1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，分析它們與患者臨床病理特征及生存期之間的關(guān)系，探索胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。方法 將胃癌、癌旁組織制作組織芯片，采用免疫組化法檢測(cè)Notch1、DLL4和HES1的表達(dá)，隨訪患者，分析它們的表達(dá)與患者臨床病理特征及生存期之間的關(guān)系。結(jié)果Notch1在胃癌、癌旁及對(duì)照組中的表達(dá)陽性率分別為48.30%、25.00%和16.67%，三者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Notch1的表達(dá)陽性率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中為41.3%，顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(61.28%，P<0.05)；在其他病理特征間Notch1表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DLL4在胃癌、癌旁和對(duì)照組中的表達(dá)陽性率分別為55.94%、45.7%和56.67%，三者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在不同病理特征間DLL4的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HES1在胃癌、癌旁和對(duì)照組中的表達(dá)陽性率分別為36.64%、34.40%和33.3%，三者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HES1在低分化胃癌中的表達(dá)陽性率為51.43%，高于高/中分化組(31.25%，P<0.05)；在其他病理特征間HES1的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Notch1、DLL4和HES1陽性組和陰性組生存期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論胃癌組織中Notch1呈高表達(dá)，可作為胃癌診斷和治療的靶點(diǎn)；Notch1的表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)；HES1在低分化胃癌中表達(dá)升高，可能是胃癌分化程度的一個(gè)標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：胃癌；Notch1；DLL4；HES1；臨床病理特征；生存期

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2015.02.018

基金項(xiàng)目：甘肅省科技支撐計(jì)劃(1011FKCA120)

收稿日期：(2014-07-20)

作者單位：730000蘭州大學(xué)病原生物學(xué)研究所，甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(何黎黎，韓儉)；730000甘肅蘭州，甘肅省第二人民醫(yī)院消化科(張富花，張錦華，莊劍波)；730000蘭州大學(xué)病理學(xué)研究所(張建剛)

通信作者：韓儉，Email: hanj@lzu.edu.cn

Relationship between Notch1, DLL4 and HES1 expression and clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancerHELi-li,HANJian.DepartmentofPathogenicBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,KeyLabofPreclinicalStudyofNewDrugsofGansuProvince,LanzhouUniversity,Lanzhou(730000),China.ZHANGFu-hua,ZHANGJin-hua,ZHUANGJian-bo.DepartmentofGastroenterology,SecondPeople′sHospitalofGansuProvince,Lanzhou(730000),China.ZHANGJian-gang.DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,LanzhouUniversity,Lanzhou(730000),China

Abstract：ObjectiveThis paper detected Notch signaling components--Notch1, DLL4 and HES1 expression in the gastric cancer and follow-up patients survival in order to analyze their relationship with clinicopathological characteristics and survival, and to explore the mechanism of gastric cancer development. MethodsGastric cancer and paracancerous tissue cases were used to manufacture tissue microarray. Immunohistochemistry was used to detect Notch1, DLL4 and HES1 expression. Patients′ survival time were followed up. The relationship between Notch1, DLL4 and HES1 expression and clinicopathological characteristics, and survival of patients were analyzed. ResultsThe Notch1 positive rate in the gastric cancer, paracancerous tissue, and control group was 48.30%, 25.00% and 16.67%, and the expression of gastric cancer group was significantly higher than that of other groups (P<0.05). The positive rate in the gastric cancer with lymph node metastasis group (41.3%) was significantly lower than that without lymph node metastasis group (61.28%) (P<0.05). The DLL4 positive rate in the gastric cancer, paracancerous tissue, and control group was 55.94%, 45.7% and 56.67% respectively, there was no significant difference between different groups (P>0.05). The HES1 positive rate in the gastric cancer, paracancerous tissue, and control group was 36.64%, 34.40% and 33.3%, and there was no significant difference between different groups (P>0.05). The HES1 positive rate (51.43%) in poorly differentiated gastric cancer was significantly higher than that in the high/middle differentiation group (P<0.05). There was no relationship between Notch1, DLL4 and HES1 expression and the patients′ survival time (P>0.05). ConclusionsGastric cancer tissues showed high expression of Notch1 which can be used as a target for gastric cancer diagnosis and treatment. Notch1 expression was negatively correlated with lymph node metastasis. HES1 expression increased in poorly differentiated gastric cancer, which may be act as an indicator of the degree of differentiation.

Key words：Gastric cancer; Notch1; DLL4; HES1; Clinicopathologic characteristic; Survival

胃癌是全球常見和高致死率的惡性腫瘤之一，2011年大約有738 000人死于胃癌[1]。胃癌的形成是多因素作用的結(jié)果。正常機(jī)體胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖與凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡依賴于體內(nèi)多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的精細(xì)調(diào)節(jié)，一旦平衡被破壞，細(xì)胞正常的增殖、凋亡等生物學(xué)行為會(huì)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞異常增生、分化，甚至發(fā)生腫瘤。在腫瘤發(fā)展過程中，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與改變細(xì)胞黏附性、基質(zhì)降解、新生血管和淋巴管形成以及逃逸機(jī)體免疫等多個(gè)環(huán)節(jié)，共同協(xié)助腫瘤持續(xù)增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。

Notch信號(hào)通路是干細(xì)胞形成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中非常重要的一步，對(duì)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡具有廣泛的調(diào)控作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路的配體DLL4在調(diào)控血管的萌發(fā)和分支形態(tài)中扮演著重要的角色[3]。Notch信號(hào)的下游基因HES1與成骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力有關(guān)[4]。本研究通過應(yīng)用組織芯片，檢測(cè)Notch 信號(hào)通路中Notch1、DLL4和HES1蛋白在胃癌、癌旁及淋巴結(jié)中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與患者病理特征的關(guān)系以及對(duì)患者生存期和預(yù)后的影響，有助于進(jìn)一步探討胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

1資料與方法

1.1　 研究對(duì)象

本研究選取1999年至2004年甘肅武威腫瘤醫(yī)院的胃癌患者的術(shù)后石蠟標(biāo)本，共192例胃癌組織及56例癌旁組織 (取材距癌組織邊緣>60 mm)。所有患者均有詳細(xì)的臨床資料和手術(shù)紀(jì)錄，術(shù)前均未行化學(xué)治療、放射治療。胃癌患者中男15l例、女41例，年齡30～73歲，中位年齡55歲。病變局限于黏膜和肌層內(nèi)5l例(其中黏膜層8例)，浸及漿膜或漿膜外141例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移116例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移76例；低分化癌99例，中分化癌45例，高分化癌48例；腸型96例，彌漫型84例，混合型12例。取30例當(dāng)?shù)赝谖哥R檢查無癌變患者的胃黏膜作對(duì)照。所有標(biāo)本均征得患者同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2　試劑

SP-9000及DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Notch1、DLL4、HES1多克隆抗體(香港Abcam，按說明書稀釋，稀釋度分別為：Notch1 1∶200，DLL4 1∶50，HES1 1∶100)。用已知陽性片作為陽性對(duì)照(由所購試劑公司提供)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3　方法

1.3.1組織芯片制備制作空白模具蠟塊，打出6×7個(gè)間距為1 mm、直徑為2 mm的孔。標(biāo)本常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察選取1個(gè)代表性位點(diǎn)，采集直徑為2 mm的組織芯放入模具蠟塊相應(yīng)孔內(nèi)，左上角兩孔用鼠組織定位。石蠟包埋，制成組織芯片。

1.3.2免疫組化染色依照試劑說明書，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法對(duì)Notch1、DLL4和HES1進(jìn)行染色檢測(cè)。凡染色過程中掉片者被淘汰。

1.3.3結(jié)果判斷參照Masunaga等[5]的方法，對(duì)Notch1、DLL4和HES1染色結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分：根據(jù)組織細(xì)胞的染色范圍，陽性細(xì)胞數(shù)<5%、5%～25%、26%～50%、>50%以上分別計(jì)為0、1、2、3分； 根據(jù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度，按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別判定為-、+/-、+、++，即0、1、2、3分。最后依據(jù)兩項(xiàng)計(jì)分之和來綜合判斷，≥3分者為陽性，≤2分者為陰性。

1.4　隨訪及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用電話、上門詢問等方法對(duì)192例患者進(jìn)行隨訪，有111 例獲得隨訪，隨訪時(shí)間為術(shù)后6～79個(gè)月。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，并進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存分析用Kaplan-Meier曲線，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　 Notch1、DLL4和HES1在不同組織中的表達(dá)情況

組織芯片經(jīng)過免疫組化染色后，可見Notch1主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，少數(shù)在細(xì)胞核表達(dá)，呈淡黃色或棕黃色或棕褐色(見圖1a)。Notch1在胃癌、癌旁及對(duì)照組中的表達(dá)陽性率分別為48.30%、25.00%和16.67%，胃癌組陽性率顯著高于癌旁組織及對(duì)照組，三者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中胃癌組顯著高于癌旁組(P<0.05)和對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1　Notch1在不同病理組織中的表達(dá)情況

注：與癌旁組織和對(duì)照組比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP>0.05

正常組織中，DLL4主要在細(xì)胞膜表達(dá)，在異型增生和癌組織中則表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)(見圖1b)。DLL4在胃癌、癌旁組織和對(duì)照組中的表達(dá)陽性率分別為55.94%(80/143)、45.7%(16/35)和56.67%(17/13)，三者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.263，P=0.532)。

HES1主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，呈淡黃色或棕黃色或棕褐色(見圖1c)。HES1在胃癌、癌旁組織和對(duì)照組中的表達(dá)陽性率分別為36.64%(48/131)、34.40%(11/32)和33.3%(10/30)，三者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.148，P=0.929)。

注：1aNotch1；1bDLL4；1cHES1；1d陰性對(duì)照

圖 1Notch1、DLL4和HES1在胃癌組織中的表達(dá)

(免疫組化染色，×400)

2.2　Notch1、DLL4和HES1共表達(dá)結(jié)果分析

Notch1和DLL4共同陽性率為15.09%，兩者無相關(guān)性(r=-0.036，P=0.584)。Notch1和HES1共同陽性率為12.21%，兩者無相關(guān)性(r=-0.052，P=0.450)。DLL4和HES1共同陽性率為15.57%，兩者無相關(guān)性(r=0.000，P=0.996)。Notch1、DLL4和HES1共同陽性率為4.72%，三者無相關(guān)性(r=-0.014，P=0.901)。

2.3　Notch1、DLL4和HES1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中Notch1表達(dá)陽性率(41.3%)顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(61.28%，χ2=5.797，P=0.016)。在其他不同病理特征組比較中，Notch1陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同胃癌病理特征之間DLL4表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腸型胃癌的DLL4陽性率(50.63%)與彌漫型胃癌(35.95%)比較，有升高的趨勢(shì)(P=0.056)。HES1在低分化胃癌組織中陽性率(51.43%)顯著高于高/中分化組(31.25%)(χ2=4.499，P=0.029)。在其他不同臨床病理特征組比較中，HES1陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4　Notch1、DLL4和HES1的表達(dá)與生存期分析

應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示隨訪到的111例患者的半數(shù)生存期為(34.21±2.78)個(gè)月(2～79個(gè)月)。Notch1陽性組和陰性組的平均生存期分別為(49.41±6.55)個(gè)月和(44.07±6.01)個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DLL4陽性組和陰性組的平均生存期分別為(39.78±5.17)個(gè)月和(56.86±7.20)個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HES1陽性組和陰性組的平均生存期分別為(35.00±7.37)個(gè)月和(49.80±5.54)個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

Notch信號(hào)通路由跨膜的受體、配體、核內(nèi)結(jié)合蛋白及靶基因4部分組成，在胚胎正常發(fā)育、細(xì)胞分化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理病理過程中起著重要的作用[6-7]。目前發(fā)現(xiàn)的哺育動(dòng)物Notch受體包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4 四種，為單鏈跨膜蛋白，具有細(xì)胞表面受體和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能。Notch信號(hào)的配體在果蠅中稱Delta和Serrate，哺乳動(dòng)物中與Delta同源的配體稱為Delta樣分子(DLL)，與Serrate同源的配體稱為Jagged，共包括5種配體分子，即DLL1、DLL3、DLL4、Jagged-1 和Jagged-2。Notch信號(hào)配體與受體的DSL結(jié)構(gòu)域結(jié)合，經(jīng)過γ-分泌酶介導(dǎo)的蛋白酶酶切后，Notch受體的活化形式NICD被釋放入細(xì)胞質(zhì)中，并易位入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，發(fā)揮對(duì)靶基因的調(diào)控作用。Notch信號(hào)影響的靶基因主要包括含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域的HES和HRT家族[8]。

研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路與多種實(shí)體腫瘤如肺腺癌、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[9-11]。4種Notch受體成員中，Notch1是在腫瘤組織中最常被檢測(cè)到的[12]。關(guān)于Notch在胃癌組織中的表達(dá)情況，目前研究報(bào)道有差異，大多數(shù)研究支持在胃癌組織表面Notch1的表達(dá)升高[13]，亦有研究報(bào)道降低[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，Notch1在胃癌組織中的表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織和對(duì)照組，提示Notch1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，但與患者的生存期無相關(guān)性，Notch1可作為胃癌診斷和治療的靶點(diǎn)。本研究還顯示，Notch1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)陽性率下降，其機(jī)制需要進(jìn)一步探討。研究表明，Notch1受體活化后與胃癌進(jìn)展的關(guān)系與環(huán)氧合酶-2(COX-2)相關(guān)。Notch1受體活化后的細(xì)胞內(nèi)片段N1IC可促進(jìn)細(xì)胞集落形成能力和人胃腺癌SC-M1細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)。N1IC和C啟動(dòng)子結(jié)合因子1(CBF1)結(jié)合后，與COX-2啟動(dòng)子連接，通過依賴CBF1的途徑促進(jìn)COX-2在SC-M1細(xì)胞株中的表達(dá)。COX-2通過前列腺素E2與相鄰細(xì)胞的細(xì)胞膜EP受體結(jié)合，經(jīng)G2蛋白偶聯(lián)途徑或過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)促進(jìn)胃癌生長(zhǎng)[15]。另外，Notch1可通過直接作用于核因子-κB(NF-κB)下游的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和/或caspase-3下游的靶基因而發(fā)揮抑制凋亡作用[16]。

DLL是Notch信號(hào)的重要配體，主要包括DLL1、DLL3和DLL4，均為跨膜糖蛋白，N端富含有半胱氨酸的DSL基序，可以與Notch結(jié)合而活化Notch信號(hào)[17]。血管的形成在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中起主要的作用。DLL4在人類多種腫瘤血管組織中過表達(dá)，且DLL4的高表達(dá)受血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的正向調(diào)節(jié)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，DLL4在胃癌、癌旁組織和對(duì)照組細(xì)胞表面的表達(dá)，以及DLL4陽性/陰性表達(dá)的患者的病理特征、生存期之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。關(guān)于DLL4表達(dá)與胃癌的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。

HES是Notch信號(hào)系統(tǒng)的下游靶基因，屬于bHLH基因家族[8]，表達(dá)廣泛。HES1參與細(xì)胞的分化，可使多種不成熟細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)，可能在多種腫瘤的發(fā)生中起到癌基因的作用[19]。Notch信號(hào)活化后，酶切產(chǎn)生的NICD 進(jìn)入核內(nèi)，激活下游靶基因HES1，HES1通過負(fù)性調(diào)節(jié)抑癌的磷酸酶和張力蛋白(PTEN)基因，活化磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路，從而促進(jìn)腫瘤增殖、浸潤(rùn)和侵襲[20]。本研究結(jié)果顯示，HES1在胃癌、癌旁組織和對(duì)照組細(xì)胞表面的表達(dá)，以及HES1陽性/陰性表達(dá)的患者生存期之間差異均未見顯著性差異。但是HES1表達(dá)與胃癌的分化程度密切相關(guān)，在低分化胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，提示HES1可作為反映胃癌分化程度的重要標(biāo)志物。

Notch1、DLL4和HES1的表達(dá)與胃癌患者的生存期之間無相關(guān)性，提示Notch信號(hào)系統(tǒng)不是胃癌獨(dú)立的預(yù)后因素。

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(本文編輯：林磊)