哈蟆油蛋白抗疲勞活性及SDS-PAGE凝膠成像分析研究

鮑悅1，宗穎2，孫佳明1*，張輝1*

(1.長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，長春 130117；2.吉林農(nóng)業(yè)大學，長春 130117)

摘要：目的對哈蟆油蛋白抗疲勞活性及不同來源的哈蟆油與混偽品的鑒別研究。方法采用Lowry法測定哈蟆油總蛋白的含量，并運用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離哈蟆油總蛋白；采用整體動物實驗觀察小鼠游泳和爬桿時間;利用SDS-PAGE和凝膠成像分析系統(tǒng)對不同來源哈蟆油及其混偽品進行鑒別。結(jié)果測得哈蟆油水溶性蛋白的含量為42%，哈蟆油中蛋白的分子量在1萬～12萬可以分離出較清晰的蛋白質(zhì)點,并具有7條主蛋白帶；哈蟆油組和哈蟆油蛋白組相對于對照組均能延長小鼠游泳和爬桿的時間，差異具有統(tǒng)計學意義，且哈蟆油蛋白組優(yōu)于哈蟆油組；經(jīng)SDS-PAGE電泳的凝膠成像分析系統(tǒng)分析，表明4個不同地區(qū)的哈蟆油均有相同的電泳行為,泳道上有6條主帶，而偽品大蟾蜍的干燥輸卵管只有一條明顯的主譜帶。結(jié)論哈蟆油總蛋白是哈蟆油中抗疲勞有效組分,SDS-PAGE電泳的凝膠成像分析法可用于不同來源的哈蟆油與混偽品的鑒別，為哈蟆油的開發(fā)利用提供了必要的科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞：哈蟆油；活性蛋白；SDS-PAGE凝膠成像分析

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.05.020

中圖分類號：R282.74文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)05-0498-04

基金項目:國家中醫(yī)藥行業(yè)專項名貴珍稀動物藥及混偽品鑒定技術(shù)及規(guī)范應(yīng)用研究(2015468002-2)；吉林省科技廳重點項目(YYZX201007)。

作者簡介:鮑悅(1990-)，女，碩士研究生，主要從事中藥學研究。

收稿日期:(責任編輯：張瑞彬2014-04-10)

*通信作者:張輝，電話-(0431)86172080,電子信箱-zhanghui_8080@163.com

孫佳明，電話-(0431)86172280,電子信箱-sun_jiaming2000@163.com

Analysis and Research on the anti fatigue activity of Oviductus

Ranae protein and SDS-PAGE gel imaging

BAO Yue1,ZONG Ying2,SUN Jiaming1*,ZHANG Hui1*

(1.Traditional Chinese medicine and biological engineering research and development center,

Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;

2.Jilin Agricultural University,Changchun 130117,China)

Abstract:ObjectiveStudy on Anti fatigue activity of Oviductus Ranae protein and identification of different sources of Oviductus Ranae and adulterants.MethodsDetermination of content of total protein of toad oil by Lowry method,separate the total proteins of toad oil using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis;To observe the mice swimming time and pole climbing time using the whole animal experiment;Analysis system with SDS-PAGE and gel imaging to identify different sources of toad oil and their adulterants.ResultsThe measured content of toad oil soluble protein was 42%;The relative molecular weight is between 1 million-12 million and clear protein spots can be separated In this interval,there are seven main protein bands;Oviductus Ranae group and the Oviductus Ranae protein group compared with the control group could prolong mice swimming and climbing pole time,with statistical significance,and the Oviduct-us Ranae protein group was better than that of Oviductus Ranae group.By SDS-PAGE electrophoresis gel imaging analysis system analysis,showed that Oviductus Ranae in four different areas of oil have the same electrophoresis,there are six main bands,Adulterants Bufo drying fallopian tube only one obvious main bands.ConclusionsThe total protein of Oviductus Ranae is toad oil anti fatigue component,SDS-PAGE electrophoresis gel imaging analysis method can be used for different sources of toad oil identification and adulterants,To provide the necessary scientific basis for the development and utilization of Oviductus ranae.

Keywords:Oviductus Ranae;protein activity;SDS-PAGE gel imaging

哈蟆油(Oviductus Ranae)為蛙科動物中國林蛙RanatemporariachensinensisDavid雌蛙的干燥輸卵管。據(jù)《中華人民共和國藥典》(2010年版)1部收載，哈蟆油具有補腎益精，養(yǎng)陰潤肺的功效。臨床用于陰虛體弱，神疲乏力，心悸失眠，盜汗不止，癆嗽咳血等癥的治療[1-2]。多年來，我國學者對哈蟆油進行了較為全面、系統(tǒng)的研究[3-12],在前人對哈蟆油研究的基礎(chǔ)上[13-17]，本實驗對哈蟆油活性蛋白的提取、蛋白含量、藥效學考察等方面進行了更加系統(tǒng)深入的研究。由于國內(nèi)外市場對哈蟆油的需求量不斷增加，市場銷售價格昂貴,因此市場上出現(xiàn)較多的偽品和摻雜品,例如馬鈴薯、甘薯加工品、鱈魚(明太魚)精巢、瓊脂蛋白胨、青蛙油、中華大蟾蜍輸卵管等。尤其是中華大蟾蜍輸卵管在性狀特征上與哈蟆油極為相似，為保證用藥的安全有效，需對其進行有效的真?zhèn)舞b別。本實驗采用SDS-PAGE和凝膠成像分析系統(tǒng)相結(jié)合的方法,針對不同來源的哈蟆油及其偽品的總蛋白進行比較實驗，為哈蟆油的開發(fā)利用提供了必要的科學依據(jù)。

1實驗材料

1.1實驗儀器Agilent 1100高效液相色譜儀，凝膠成像及分析系統(tǒng)Lab Works 4.6，F(xiàn)O-1000真空冷凍干燥機，DYCZ-24D型雙垂直電泳槽，ECP3000型三恒電泳儀等。

1.2實驗試劑三羥甲基氨基丙烷(Tris)，丙烯酰胺(Acrylamide)，N，N亞甲基雙丙烯酰胺(N，N-Methylene Bisacrylamideminimu)，過硫酸銨(Ammonium Persulfate)，十二萬基硫酸鈉(SDS)，L-甘氨酸(L-Glycune)，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol),考馬斯亮藍(Marker，Coomassie Brilliant Blue)，溴酚藍(Bromphenol Blue)，小牛血清。所用生化試劑均為進口分裝及電泳純，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3實驗藥材哈蟆油來自吉林省舒蘭市，吉林省樺甸市，內(nèi)蒙古，青海省。經(jīng)長春中醫(yī)藥大學姜大成教授鑒定為蛙科動物中國林蛙(Rana chensinensis)的干燥輸卵管。

2實驗方法

2.1哈蟆油總蛋白的提取取哈蟆油干品200 g，剔除表面筋膜，研缽研磨成顆粒狀，用100倍量pH 7.5 200 mmol的磷酸鹽緩沖液，于4 ℃浸泡，分次用高速組織搗碎機粉碎，直至勻漿液成為乳白色糊狀，所得勻漿液離心(4 ℃，12 000 r/min，20 min)，合并上清液，沉淀烘干待用。清液加95%乙醇至醇濃度達到50%，4 ℃靜置24 h，濾過，清液減壓濃縮至糖漿狀，凍干得到哈蟆油總蛋白粗品，-80 ℃保存待用。

2.2哈蟆油蛋白的含量測定按Lowry法[19]測定哈蟆油蛋白的濃度,以牛血清白蛋白為標準蛋白。

2.2.1標準曲線繪制配制1 mg/mL牛血清蛋白(BSA)溶液，稱取10 mg蒸餾水溶解，定容到10 mL作為標準溶液。分別吸取10、20、40、80、100 μL的標準溶液，加水至100 μL,空白調(diào)零管直接吸取100 μL。每管加入5 mL的考馬斯亮藍試劑，快速混勻，室溫反應(yīng)5 min，在5～20 min之間檢測595 nm波長下的吸光值。需注意的是石英比色皿可與CBB-G250染料結(jié)合，故用玻璃或塑料比色皿檢測，檢測完畢用醇涮洗。以牛血清蛋白標準溶液在每管中的蛋白濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，以測得的吸光值為縱坐標(Y)，作標準曲線回歸方程。

2.2.2樣品含量測定稱取哈蟆油蛋白粗提物0.010 15 g，加入200 mmol Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)10 mL于離心管中，12 000 r/min離心1 min，取上清液。另取試管1支，加入上清液0.4 mL，蒸餾水0.6 mL，再加入試劑甲5 mL，混勻后放置10 min，然后加入試劑乙0.5 mL，迅速混勻，室溫下放置30 min，以不含蛋白質(zhì)的1號試管為對照，與樣品試管內(nèi)的溶液于640 nm波長下比色，記下吸光度。

2.3總蛋白的SDS-PAGE電泳分析參照Laemmli方法[18]進行電泳，采用不連續(xù)膠系統(tǒng)，5%濃縮膠和12%分離膠，用考馬斯亮藍法染色。標準相對分子量蛋白(marker,Amersham公司出品)為兔磷酸化酶B(97.4 kDa)，牛血清白蛋白(66.2 kDa)，兔肌動蛋白(43.0 kDa)，牛碳酸酐酶(31.0 kDa),胰蛋白酶抑制劑(20.1 kDa)，雞蛋清溶菌酶(14.4 kDa)。樣品為上述所得總蛋白凍干品。

2.4凝膠成像法對哈蟆油真?zhèn)舞b別分別取舒蘭、樺甸、內(nèi)蒙古、青海的哈蟆油干品及偽品大蟾蜍輸卵管的干品，剔除表面筋膜，研缽研磨成顆粒狀，精密稱定1 g，分別用pH 7.5 200 mmol磷酸鹽緩沖液,定容至100 mL，4 ℃浸泡膨脹24 h，用高速組織搗碎機粉碎，直至勻漿液成為乳白色糊狀，所得勻漿液離心(4 ℃，12 000 r/min，20 min)，取上清液參照Laemmli方法[18]進行電泳，凝膠成像及分析系統(tǒng)進行分析。

2.5哈蟆油總蛋白抗疲勞活性的考察

3實驗結(jié)果

3.1標準曲線繪制以牛血清白蛋白為標準蛋白，得到吸光度Y與濃度X(μg/mL)的回歸方程為Y=0.001 7X+0.015 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。

3.2哈蟆油蛋白的含量測定采用紫外分光光度法測得樣品吸光度，根據(jù)上述的回歸方程算得樣品中蛋白質(zhì)含量，計算哈蟆油蛋白質(zhì)百分含量。結(jié)果表明哈蟆油的水溶性蛋白的含量約為42%。

3.3總蛋白SDS-PAGE電泳分析聚丙烯酰胺凝膠電泳表明，哈蟆油中蛋白的分子量在1萬～12萬之間可以分離出較清晰的蛋白質(zhì)點，有7條主蛋白帶。

3.4凝膠成像法對哈蟆油真?zhèn)舞b別由電泳的凝膠成像及分析系統(tǒng)分析表明舒蘭、樺甸、內(nèi)蒙古、青海的哈蟆油均有相同的電泳行為，泳道上有6條主帶,而偽品大蟾蜍的干燥輸卵管只有一條明顯的主譜帶。結(jié)果見圖1～圖2。

1Maker　2舒蘭　3樺甸　4內(nèi)蒙古　5青?！?、7　大蟾蜍(由左至右) 圖1　不同來源哈蟆油及其偽品電泳圖譜

1Maker　2舒蘭　3樺甸　4內(nèi)蒙古　5青?！?、7　大蟾蜍 圖2　不同來源哈蟆油及其偽品蛋白凝膠成像分析圖

3.5哈蟆油總蛋白抗疲勞活性的考察

3.5.1小鼠游泳實驗結(jié)果實驗結(jié)果表明:哈蟆油組和哈蟆油蛋白組相對于對照組均能延長小鼠游泳時間，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表1。

組 別劑量/(mg/kg)吞噬指數(shù)對照組 —26.750±5.007 陰性對照組 2000188.875±35.004###哈蟆油組 1155150.250±46.582###哈蟆油蛋白組2000106.500±32.575###

注：與對照組比較，###P<0.001

3.5.2小鼠爬桿實驗結(jié)果實驗結(jié)果表明:哈蟆油組和哈蟆油蛋白組相對于對照組均能延長小鼠爬桿時間，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表2。

組 別劑量/(mg/kg)爬桿時間/s對照組 —22.750±7.769 陰性對照組 2000189.250±59.816###哈蟆油組 1155191.375±42.588###哈蟆油蛋白組2000128.625±36.965###

注：與對照組比較，###P<0.001

4結(jié)論

從小鼠游泳耗竭時間可以反映出某種物質(zhì)對抗疲勞的效果[18]，并且本實驗對小鼠爬桿時間也進行了考察，實驗結(jié)果顯示，哈蟆油組和哈蟆油蛋白組相對于對照組均能延長小鼠游泳和爬桿的時間，差異具有統(tǒng)計學意義，并且哈蟆油蛋白組優(yōu)于哈蟆油組，表明哈蟆油蛋白是哈蟆油抗疲勞的有效組分。

基于上述實驗結(jié)果，本研究以哈蟆油蛋白為研究對象，依據(jù)有效成分和藥材質(zhì)量控制相結(jié)合的原則，運用SDS-PAGE和凝膠成像分析系統(tǒng)對不同來源的哈蟆油及其混偽品進行鑒別,發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)越的鑒別能力。該研究結(jié)果可以從技術(shù)上對藥材市場中哈蟆油的混偽品進行有效的鑒別，為保證臨床用藥的安全及有效性提供有利的技術(shù)保障，同時也為哈蟆油保健食品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:1部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2]《中國藥用動物志》協(xié)作組.中國藥用動物志[M].天津:天津科學技術(shù)出版社,1983.

[3]謝程,張?zhí)m杰,張煒煜,等.哈蟆油對免疫功能低下或增強小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國老年學雜志,2010,30(11):3132-3133.

[4]顧紅纓,林卓,徐云,等.哈蟆油調(diào)節(jié)小鼠細胞免疫功能的實驗研究[J].吉林中醫(yī)藥,2010,30(12):1103-1104.

[5]王麗蘭,王之光,姜言功,等.哈士蟆油成分分析[J].中草藥,1982,13(9):5.

[6]崔桂友.哈蟆油的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和化學成分測定[J].生物學雜志,2000,17(1):27.

[7]王紅燕,徐綏緒.哈士蟆油化學及藥理學研究概況[J].中成藥,1998,20(9):39.

[8]范玉林,崔香順,姚玉霞.哈士蟆油成分研究的進展[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報,1996,18(3):105.

[9]盧立明,宋少江,武勇.哈蟆卵油化學成分研究[J].中國藥物化學雜志,2001,11(4):224.

[10]劉仁杰,孫,王剛,等.中國林蛙產(chǎn)品的開發(fā)現(xiàn)狀與研究進展[J].糧油加工(電子版),2014(12):72-75.

[11]袁文彬,李宜平,王淑敏.林蛙油不同干燥處理方法蛋白質(zhì)含量測定[J].吉林中醫(yī)藥,2011,31(2):163-164.

[12]楊名赫,佟慶,高利,等.東北林蛙的分類與哈蟆油[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問,2011(12):229.

[13]白雪媛.哈蟆油HPLC指紋圖譜的研究及其在真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用[D].長春:長春中醫(yī)藥大學,2007.

[14]高曉晨,劉冬,白俊武,等.哈蟆油基原物種DNA分子鑒定研究[J].吉林中醫(yī)藥,2014,34(11):1147-1148,1162.

[15]周光新,張鶴,董穎,等.胰蛋白酶酶解法制備哈蟆油蛋白工藝的研究[J].食品科技,2013(10):236-240.

[16]LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T.4[J].Nature,1970,227(259):680.

[17]張龍翔,張庭芳,李令媛.生化實驗方法與技術(shù)[M].2版.北京:高等教育出版,1997:314.

[18]李國莉,楊建軍,任彬彬,等.寧夏枸杞對密閉缺氧小鼠自由基防御體系的影響[J].衛(wèi)生研究,2002,31(1):30-31.