六神丸對食管癌移植瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因的影響

黃立中,張慧，田莎，李俊俊，張遠(yuǎn)

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長沙 410208)

摘要：目的探討六神丸對食管癌移植瘤組織細(xì)胞凋亡與B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制。方法通過皮下注射細(xì)胞懸液建立食管癌移植瘤模型,將48只裸鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、順鉑組(DDP)、六神丸高劑量組、六神丸中劑量組、六神丸低劑量組，按照給藥方案用藥，用藥20 d后處死動(dòng)物，剝?nèi)×鼋M織，TUNEL(原位末端標(biāo)記法)檢測瘤體組織細(xì)胞凋亡指數(shù),免疫組化法檢測瘤體組織Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果六神丸高、中、低劑量各組細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于模型組，給藥各組瘤體組織內(nèi)Bcl-2的表達(dá)活性均明顯下降。結(jié)論六神丸通過下調(diào)腫瘤組織Bcl-2表達(dá)活性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡是六神丸抑瘤作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：六神丸；細(xì)胞凋亡指數(shù)；Bcl-2

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.01.016

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)01-0053-04

基金項(xiàng)目:湖南省研究生創(chuàng)新

作者簡介:黃立中(1956-)，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事惡性腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合防治研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：張瑞彬2014-08-06)

Effect of Liushen Pill on the apoptosis index and expression of

Bcl-2 of esophagus carcinoma xenografts

HUANG Lizhong,ZHANG Hui,TIAN Sha,LI Junjun,ZHANG Yuan

(College of Integradted Chinese and Western medicine,TCM University of Hunan,Changsha 410208,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Liushen Pill on the apoptosis index and the expression of bcl-2 in esophagus carcinoma xenografts.MethodsThe model of esophagus carcinoma xenografts in nude mice was established by hypodermic injection with cell suspension.These mice were randomly divided into 6 groups as follows:blank group,model group,DDP group,high dosage of Liushen Pill group,middle dosage group,low dosage group.The models were treated by dosage regimen.These mice were sacrificed after 20 days treatment and the tumor tissue was peeled.The apoptosis index was examined by TUNEL.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Bcl-2.ResultsThe high,middle,low dosage group can effectively down-regulate the expression of Bcl-2.ConclusionLiushen Pill can inhibit tumor by down-regulating the expression of Bcl-2 and promoting apoptosis.

Keywords:Liushen Pill;apoptosis index (AI);Bcl-2

細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞的一種主動(dòng)、程序性死亡，主要是通過內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活而發(fā)生的細(xì)胞死亡過程。通過體內(nèi)多種因素參與調(diào)節(jié)，是機(jī)體細(xì)胞維持正常新陳代謝的主要形式之一。激活細(xì)胞凋亡基因的缺失或細(xì)胞凋亡基因的過度表達(dá)都將導(dǎo)致細(xì)胞無序的增殖，特別是腫瘤細(xì)胞。腫瘤的發(fā)生不僅與各種癌基因失活有關(guān)，而且與腫瘤細(xì)胞具有逃過細(xì)胞周期監(jiān)測的能力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的關(guān)鍵基因改變等密切相關(guān)[1]，其中細(xì)胞凋亡過程失控能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡能在一定程度上達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。故細(xì)胞凋亡現(xiàn)已逐漸為抗腫瘤作用機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一，且成為開發(fā)治療藥物的新靶點(diǎn)。在本課題組前期研究中，結(jié)果顯示六神丸具有抗食管癌作用，本實(shí)驗(yàn)是在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察六神丸是否能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡，從而了解六神丸抗食管癌的作用機(jī)制，為六神丸在臨床的廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康6～8周齡雄性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量為18～22 g，48只，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，批號(hào)：SCXK(湘)2009-0004。

1.2細(xì)胞株人食管癌細(xì)胞株(Eca-109)，購于湖南長沙遠(yuǎn)泰生物技術(shù)公司。

1.3主要試劑胰蛋白酶，invitrogen公司。高糖DMEM培養(yǎng)液，invitrogen公司。小牛血清，浙江天杭生物科技有限公司。鼠抗人VEGF單克隆抗體、SABC免疫組化試劑、Bcl-2抗小鼠單克隆抗體、原位細(xì)胞凋亡試劑盒TUNEL，購自武漢博士德公司。

1.4實(shí)驗(yàn)藥物六神丸，10粒/支×6支/盒(每1 000粒重3.125 g)，由雷允上藥業(yè)有限公司蘇州雷允上制藥廠生廠，產(chǎn)品批號(hào):IA18005。順鉑(10 mg/支)，由齊魯制藥有限公司出品，產(chǎn)品批號(hào)：0070152DB。

1.5主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備SW-CJ-1CV超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰公司。XDS-1B倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠。SHEL-LAB CO2培養(yǎng)箱，Hitachi。TDZ5-40臺(tái)式離心機(jī)，長沙天創(chuàng)儀器公司。普通光學(xué)顯微鏡(CK-Z)。ZDX-35B高壓蒸汽消毒器，上海申安器械廠。GG112-10B恒溫水浴箱，上海醫(yī)療器械廠。101B-2干燥箱，上海亞明公司。雙重純水蒸餾器,上海玻璃儀器一廠。-20 ℃、4 ℃電冰箱，新飛電器公司。GB204分析天平；BFXS-320型離心機(jī)，河北白洋離心機(jī)廠。SLEE-CUT5062切片機(jī)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組按完全隨機(jī)的原則查隨機(jī)數(shù)字表將48只裸鼠排8只定為空白組,其余40只按同樣的方法于造模后分為5組，即模型組、順鉑組(DDP組)、六神丸高劑量組、六神丸中劑量組、六神丸低劑量組。

2.2動(dòng)物造模采用皮下注射食管癌細(xì)胞懸液方法復(fù)制食管癌移植瘤模型。首先用10%水合氯醛0.2 mL腹腔注射，以麻醉裸鼠，然后用75%乙醇消毒進(jìn)針部位，抽取0.2 mL濃度為1×107/mL的食管癌細(xì)胞懸液，注入腋部皮下，隨即皮下出現(xiàn)綠豆大皮丘,緩慢退針，稍壓針孔，造模完成。待成瘤后病理切片觀察到食管癌細(xì)胞，證明模型復(fù)制成功。

2.3給藥方法及分組給藥劑量計(jì)算方法：根據(jù)“人和動(dòng)物體表體質(zhì)量折算等效計(jì)量”體質(zhì)量計(jì)量公式，dB(g/kg)=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量。公式中，dA、dB分別表示裸鼠和人的每千克體質(zhì)量劑量，RA、RB分別表示裸鼠和人的體型分?jǐn)?shù)(裸鼠為59,人為100)，WA、WB分別表示裸鼠和人的體質(zhì)量(kg)[2]，臨床用藥劑量以體質(zhì)量60 kg成人作為參照。換算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)用量。

六神丸高、中、低劑量組：各組每只每次分別取濃度為0.266，0.133，0.067 g/mL的六神丸水溶液，根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算灌胃量，于每日9：00灌胃1次，共用藥20 d。順鉑組：現(xiàn)配濃度為0.1 mg/mL順鉑水溶液，每次每只取0.2 mL，于造模后24，48 h各腹腔注射1次，共給藥2次。模型組：于每天9：00蒸餾水0.4 mL灌胃1次，共20 d?？瞻捉M：常規(guī)給予食物、水。

2.4細(xì)胞凋亡的檢測將石蠟切片放置于60 ℃的烤箱過夜以脫蠟至水,然后在3%過氧化氫中室溫孵育5～10 min，蒸溜水沖洗后PBS緩沖液浸泡5 min，放置在構(gòu)椽酸鹽緩沖液中微波中火檔加熱5 min，再在低火檔加熱10 min，室溫中冷卻。取TUNEL試劑盒中1、2號(hào)試劑混勻，適量滴加在切片，37 ℃避光保存60 min，于熒光顯微鏡下觀測。加適量3號(hào)試劑,保持37 ℃30 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。繼續(xù)滴加新鮮配制DAB，顯微鏡下觀察顯色時(shí)間，不超過3 min，顯色后雙蒸水沖洗以終止反應(yīng)，自來水反復(fù)充分沖洗。蘇木素復(fù)染30 min后鹽酸酒精分化，自來水回藍(lán)。最后常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。

2.5腫瘤組織Bcl-2的表達(dá)4%多聚甲醛充分固定移植瘤標(biāo)本組織48 h，常規(guī)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，各標(biāo)本行4 pm連續(xù)切片3張，SABC法行Bcl-2免疫組化染色,具體步驟參照試劑盒說明。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡的變化TUNEL陽性標(biāo)記主要位于腫瘤細(xì)胞核內(nèi),染色后典型的凋亡細(xì)胞呈新月形或蠶豆?fàn)?，呈棕色或棕黃色，特別是在腫瘤壞死的周邊部位較明顯，如圖1示。

結(jié)果如表1示，模型組平均細(xì)胞面密度(3.51±2.43)，各用藥組與模型組相比較細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯增加,DDP組、六神丸高劑量組與模型組比較均有差異且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，六神丸中、低劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示：六神丸各用藥組均能促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞凋亡，其高劑量作用最為明顯，中劑量、低劑量作用差異不明顯。

3.2腫瘤組織Bcl-2表達(dá)經(jīng)Bcl-2免疫組化染色后觀察，各用藥組瘤組織及其間質(zhì)可見少量棕黃色顆粒，呈片狀或團(tuán)塊狀分布，模型組陽性表達(dá)細(xì)胞增多,如圖2示。

結(jié)果如表2示，模型組平均灰度值為(408.16±63.01),DDP組及六神丸高、中劑量組平均灰度值與模型組比較，均顯著降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各用藥組平均面密度較模型組均顯著減少，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。腫瘤細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)在六神丸高、中、低劑量組及DDP組顯著減少。

圖1　各組腫瘤細(xì)胞凋亡的變化

圖2　各組腫瘤組織Bcl-2表達(dá)

組 別平均面密度模型組3.51±2.43 DDP組12.45±1.98△△六神丸低劑量組6.28±1.71△ 六神丸中劑量組6.40±1.98△ 六神丸高劑量組8.36±2.69△△

注：與模型組比較，△ P<0.05，△△ P<0.01

注：與模型組比較，△△P<0.01

4討論

六神丸出自《雷允上誦芬堂方》，由牛黃、雄黃、蟾酥、麝香、珍珠、冰片6味藥物組成，方中以牛黃、麝香為君藥，其中麝香消瘕積聚，能行血分之滯，通經(jīng)，活血化瘀，散結(jié)止痛。佐以珍珠、冰片，其清熱解毒、消腫止痛之功更甚，兼以化腐生肌。蟾酥、雄黃為臣藥，配合君藥，清消兼?zhèn)洌沧嘟舛鞠[止痛之功?？傊裢杈哂星鍩峤舛?，散結(jié)消腫，化腐止痛之功效，對癰疽瘡癤、無名腫毒、咽喉腫痛等療效顯著?，F(xiàn)代藥理證明六神丸具有明顯的強(qiáng)心、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、麻醉等作用，臨床上對病毒感染性疾病、免疫功能失調(diào)性疾病、惡性腫瘤等疾病表現(xiàn)出獨(dú)特的療效[3]。近年來在抗腫瘤作用方面，臨床上發(fā)現(xiàn)其對食管癌、胃癌、白血病等惡性腫瘤具有一定的療效，同時(shí)在其機(jī)制的研究上也取得了一定的進(jìn)展。孫莉[4]研究發(fā)現(xiàn)六神丸能明顯下調(diào)P53基因的表達(dá)，啟動(dòng)凋亡機(jī)制，阻止腫瘤細(xì)胞惡性增殖。李海燕[5]研究發(fā)現(xiàn)六神丸可能通過誘導(dǎo)K562/ADM細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞增殖，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與抑制Bcl-2表達(dá)有關(guān)。黃利敏等[6]發(fā)現(xiàn)六神丸可能通過降低bFGF和MVD的CD34表達(dá)的機(jī)制來抑制Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生及原發(fā)腫瘤、肺轉(zhuǎn)移瘤的生長。李秀榮等[7]發(fā)現(xiàn)六神丸可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，其機(jī)理與上調(diào)caspase-3和下調(diào)survivin的表達(dá)有關(guān)。有研究[8]發(fā)現(xiàn)六神丸對人癌細(xì)胞系白血病HL-60、肝癌BEL7402、肺癌A549細(xì)胞體外生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[9]中發(fā)現(xiàn)六神丸對小鼠S180實(shí)體瘤、人移植性肝癌瘤的生長具有明顯的抑制作用。齊元富等[10]發(fā)現(xiàn)六神丸治療肺癌的機(jī)制可能與其能下調(diào)survivin的標(biāo)的，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡有關(guān)。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)六神丸組方中如雄黃[11]、麝香[12]、蟾酥[13-14]均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長。

Bcl-2是凋亡基因家族中的一個(gè)重要成員[15]，是重要的抗凋亡基因，具有抑制凋亡作用。Bcl-2基因在某些血液腫瘤如白血病、惡性實(shí)體瘤疾病中均存在高表達(dá)，其過度表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，從而延長腫瘤細(xì)胞的生存，與腫瘤組織的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有密切的聯(lián)系[16]，同時(shí)與化療和放療失敗也有一定的聯(lián)系。故本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用TUNEL和免疫組化染色方法檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bcl-2,結(jié)果顯示各用藥組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加，Bcl-2表達(dá)活性下降，這說明六神丸可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制食管癌移植瘤的生長，其機(jī)制與Bcl-2表達(dá)活性下降有關(guān)。由于六神丸是傳統(tǒng)的復(fù)方，其獨(dú)特的藥物組成表示其作用機(jī)制也是廣泛的，其獨(dú)特的療效不僅僅是與某一種機(jī)制有關(guān)，還需要更深入的研究。

六神丸在臨床上廣泛應(yīng)用，但關(guān)于治療腫瘤的研究相對較少，已有的理論、臨床研究已為其抑制腫瘤提供了一部分理論支持，隨著實(shí)驗(yàn)研究的不斷深入、細(xì)胞生物學(xué)及各項(xiàng)分子技術(shù)的成熟運(yùn)用，六神丸抗腫瘤的機(jī)制必將會(huì)不斷被發(fā)現(xiàn)，在臨床上得到更好的應(yīng)用，為中醫(yī)藥治療腫瘤提供新的途徑。

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