酶解法與LC-MS-MS相結(jié)合研究燈盞乙素在健康人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.023.html

酶解法與LC-MS-MS相結(jié)合研究燈盞乙素在健康人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

儲(chǔ)繼紅,張軍,李長(zhǎng)印,鄒沖,劉芳,居文政

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥理科，江蘇 南京210029)

中國(guó)圖書分類號(hào)：R284.1；R282.71；R944.4；R969.1

摘要：目的建立β-葡萄糖醛酸苷酶解法與LC-MS-MS法相結(jié)合測(cè)定人體血漿中燈盞乙素的苷元，研究健康男性單劑量口服燈盞花素分散片的藥代動(dòng)力學(xué)。方法血漿樣品經(jīng)β-葡萄糖醛酸苷酶水解，甲醇蛋白沉淀，色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18(2.1 mm×150 mm, 5 μm)，運(yùn)用乙腈-甲醇-水洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)燈盞乙素苷元([M-H]`-，m/z 285.0/136.8)和內(nèi)標(biāo)槲皮素([M-H]`-，m/z 301.1/120.8)。12名健康男性單劑量口服燈盞花素分散片120 mg后, 采用該方法測(cè)定血漿中燈盞乙素苷元，使用DAS 1.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果燈盞乙素苷元在4.01~513.38 μg·L`(-1)范圍內(nèi)線性良好，日內(nèi)日間精密度小于7.22%，提取回收率大于84.23%。12名健康男性單劑量口服燈盞花素分散片120 mg后，以燈盞乙素苷元為檢測(cè)對(duì)象的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為：Cmax (μg·L`(-1))：159.97±58.14；AUC(0-19) (μg·L`(-1)·h)：1151.37±279.80；AUC(0-∞) (μg·L`(-1)·h)：1194.13±264.51；Tmax (h)：6.33±1.67；T1/2 (h)：2.83±0.60。結(jié)論建立的酶解與LC-MS-MS相結(jié)合分析方法準(zhǔn)確靈敏，適用于燈盞乙素人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：燈盞乙素；燈盞乙素苷元；β-葡萄糖醛酸苷酶；酶解；LC-MS-MS；藥代動(dòng)力學(xué)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2014.01.023

文章編號(hào)：

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0108-05

收稿日期:2014-09-16,修回日期:2014-10-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No 2012ZX09303009-002)；江蘇省中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才(No LJ200906)

作者簡(jiǎn)介：儲(chǔ)繼紅(1977-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：臨床藥代動(dòng)力學(xué),Tel：025-86617141-50521,E-mail：cjh124@sina.com.cn;

通訊作者居文政(1965-)，男，博士，主任藥師，研究方向：中藥臨床藥代動(dòng)力學(xué),,Tel：025-86617141-50518,E-mail：juwz333@hotmail.com

Abstract:AimTo establish a combined method of β-glucuronidase hydrolysis and LC-MS-MS analysis for the determination of scutellarein in human plasma, and investigate the pharmacokinetics of scutellarin preparation in healthy male volunteers．MethodsPlasma samples were prepared by enzymolysis with β-glucuronidase and protein precipitation with methanol. The analytes scutellarein and quercetin (IS) were separated on an Agilent ZORBAX SB C18 column (2.1 mm×150 mm, 5 μm) with the mobile phases consisting of acetonitrile, methanol and water. Multiple reaction monitoring (MRM) on MS was used to monitor precursor to produce ion transitions of m/z 285.0→136.8 for scutellarein and m/z 301.1→120.8 for IS. After method validation, this method was applied to determine the plasma concentration of scutellarein in 12 male volunteers following single oral administration of 120 mg scutellarin preparation. Drug And Statistic software (1.0) was used to process data and the pharmacokinetic parameters were calculated. ResultsThe assay was validated with linear range of 4.01-513.38 μg·L`(-1) for scutellarein. The intra- and inter-batch precisions (RSD%) were within 7.22%. The absolute recoveries were more than 84.23%. The pharmacokinetic parameters after a single dose were as follows: Cmax(μg·L`(-1)): 159.97±58.14; AUC(0-19)(μg·L`(-1)·h): 1151.37±279.80; AUC(0-∞) (μg·L`(-1)·h): 1194.13±264.51; Tmax (h)：6.33±1.67; T1/2 (h)：2.83±0.60. ConclusionThe assay method is proved to be sensitive, accurate and convenient. It can be successfully applied to a pharmacokinetic study of scutellarin in healthy male volunteers.

燈盞花是菊科植物短葶飛蓬Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand.-Mazz.的干燥全草，又名燈盞細(xì)辛，其有效成分燈盞乙素(scutellarin)，即4′,5,6-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸苷，具有活血化瘀、抑制血小板和紅細(xì)胞的黏附及聚集，降低血液粘稠度，增加心肌供血量，改善組織缺血等作用，臨床主要用于治療高血壓、腦血栓等心腦血管疾病[1-2]。

有關(guān)燈盞乙素的動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明其生物利用度很低，在大鼠、家兔和犬體內(nèi)的生物利用度分別為2.3%[3]、0.18%[4]和0.4%[5]，然而燈盞乙素療效明顯，說(shuō)明必有其發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)存在。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，燈盞乙素本身在胃腸道內(nèi)吸收較差[6-7]，主要以苷元的形式吸收進(jìn)入體內(nèi)[8-9]。燈盞乙素苷元(scutellarein)吸收入血后，其結(jié)構(gòu)中的5、6、7和4′位上的羥基均可能與內(nèi)源性的α-D-葡萄糖醛酸發(fā)生共價(jià)結(jié)合反應(yīng)，生成一系列燈盞乙素苷元的β-葡萄糖醛酸苷[8,10-11]，故以燈盞乙素為檢測(cè)對(duì)象生物利用度很低。我們建立了先用β-葡萄糖醛酸苷酶將血漿中燈盞乙素苷元的β-葡萄糖醛酸苷水解成苷元，再通過(guò)LC-MS-MS進(jìn)行檢測(cè)的方法來(lái)研究燈盞乙素在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。該方法水解效率高、樣品前處理簡(jiǎn)單，專一性強(qiáng)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑燈盞花素分散片，漯河南街村全威制藥股份有限公司，每片含燈盞乙素20 mg，批號(hào)100602；燈盞乙素對(duì)照品，美國(guó)ChromaDex公司，批號(hào)00019097-811；燈盞乙素苷元對(duì)照品，美國(guó)ChromaDex公司，批號(hào)00019096-224；槲皮素(內(nèi)標(biāo))對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100081-200907；β-葡萄糖醛酸苷酶，美國(guó)Sigma公司，產(chǎn)品編號(hào)G0751，型號(hào)Type H-1；維生素C注射液，金陵藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格2 mL ∶0.5 g，批號(hào)110316；試驗(yàn)用水為超純水；甲醇、乙腈等試劑均為色譜純。

1.2儀器與液質(zhì)條件API 4000 LC-MS-MS聯(lián)用儀，色譜工作站Analyst 1.4.2；梅特勒 MT-5電子天平；Biofuge PrimoR冷凍高速離心機(jī)；Drict-Q5超純水機(jī)。

液相條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18(2.1 mm×150 mm, 5 μm)；流動(dòng)相: 乙腈(含0.1%甲酸) ∶甲醇∶水(含0.1%甲酸，1%異丙醇)= 40 ∶10 ∶50 (V/V)；流速：200 μL·min-1；柱溫：40℃。

質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧離子化；負(fù)離子檢測(cè)；離子源電壓：4500 V；離子源溫度：500℃；選擇離子通道：燈盞乙素苷元，[M-H]-，m/z 285.0/136.8；槲皮素，[M-H]-，m/z 301.1/120.8。

1.3受試者選擇12名健康男性受試者，體質(zhì)量62～75 kg，年齡21～29歲，經(jīng)體檢證明肝、腎功能、心電圖正常，符合受試者入選要求。簽署知情同意書，并經(jīng)倫理委員會(huì)審批同意。試驗(yàn)前兩周及試驗(yàn)期間未服用其他任何藥物。

1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)受試者于試驗(yàn)前1日和試驗(yàn)期內(nèi)勿吸煙、飲用酒類、咖啡類飲料或果汁；試驗(yàn)前1日晚17 ∶00前入?、衿诓》?，統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)晚餐，禁食10 h。次日早晨空腹服用燈盞花素分散片，用250 mL溫開水送服；服藥2 h后方可再飲水，4 h后統(tǒng)一進(jìn)食低脂肪飲食。給藥前及給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、19 h肘靜脈取血4 mL，置于加入20 μL維生素C注射液的肝素化試管中，振蕩均勻。血樣標(biāo)本1 500×g離心10 min，取血漿置-75℃冰箱中保存。

1.5血漿樣品的處理于2.0 mL塑料離心管中精密加入受試者血漿樣品0.2 mL，0.58 mol·L-1冰醋酸20 μL和10 kU·mL-1β-葡萄糖醛酸苷酶液20 μL，旋渦10 s混勻后，放入37℃水浴中水解30 min。水解完畢后立刻加入內(nèi)標(biāo)槲皮素溶液10 μL(15 872 μg·L-1)，甲醇0.8 mL，旋渦振蕩3 min，13 800×g離心5 min，吸取上清液進(jìn)行LC-MS-MS分析，進(jìn)樣量10 μL。

1.6數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)編制的DAS 1.0軟件，對(duì)受試者的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算各藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其中AUC采用梯形法計(jì)算，T1/2用藥時(shí)曲線末端相計(jì)算，Tmax和Cmax為實(shí)測(cè)值。

2結(jié)果

2.1酶解條件分別加入不同濃度的β-葡萄糖醛酸苷酶液20 μL(以0.1 mol·L-1、 pH 4.75乙酸鈉緩沖液配制成320、160、80、40、20、10、5、4、3、2、1、0.5、0 kU·mL-1)，結(jié)果顯示當(dāng)酶濃度為10 kU·mL-1時(shí)水解效率最高。另考察了酶解時(shí)間(10、20、30、45、60、120 min)的影響，發(fā)現(xiàn)酶解30 min達(dá)到峰值。

2.2特異性在本實(shí)驗(yàn)所采用的LC-MS-MS條件下，燈盞乙素苷元保留時(shí)間在2.5 min左右，內(nèi)標(biāo)槲皮素保留時(shí)間在2.8 min左右。燈盞乙素苷元和內(nèi)標(biāo)互不干擾，峰形良好，無(wú)雜峰干擾，基線平穩(wěn)，見Fig 1。

2.3介質(zhì)效應(yīng)本實(shí)驗(yàn)考察了人空白血漿經(jīng)提取后，內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)燈盞乙素苷元和內(nèi)標(biāo)槲皮素的離子抑制情況。結(jié)果顯示，燈盞乙素苷元血漿質(zhì)控樣品在7.82、39.12、391.15 μg·L-13個(gè)濃度下，LC-MS-MS介質(zhì)效應(yīng)(n=3)分別為96.51%、99.72%、97.52%；內(nèi)標(biāo)槲皮素介質(zhì)效應(yīng)(n=9)為81.35%。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍以燈盞乙素苷元血藥濃度C(分別為513.38、256.69、128.34、64.17、32.09、16.04、8.02、4.01 μg·L-1)為橫坐標(biāo)，燈盞乙素苷元峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比f(wàn)為縱坐標(biāo)，以f對(duì)C作回歸計(jì)算，得回歸方程：f=0.019 2×C-0.010 1，r=0.999 5，權(quán)重系數(shù)w=1/C2。藥物濃度與峰面積間線性關(guān)系良好，線性范圍為4.01~513.38 μg·L-1，最低定量限為4.01 μg·L-1。

2.5精密度與準(zhǔn)確度制備含燈盞乙素苷元濃度分別為391.15、39.12、7.82 μg·L-1的含藥血漿質(zhì)控樣品，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作，連續(xù)做3 d，每批每個(gè)濃度各做5份樣品，計(jì)算燈盞乙素苷元峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值f，代入當(dāng)天的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得實(shí)測(cè)濃度，由實(shí)測(cè)濃度計(jì)算批內(nèi)與批間精密度，實(shí)測(cè)濃度與加入濃度的比值即為準(zhǔn)確度，結(jié)果見Tab 1。

2.6提取回收率制備含燈盞乙素苷元濃度分別為391.15、39.12、7.82 μg·L-1的含藥血漿質(zhì)控樣品，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作，記錄峰面積A1。人空白血漿經(jīng)提取后，加入燈盞乙素苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品，記錄峰面積A2，A1和A2的比值(A1/A2×100)即為提取回收率R(%)。結(jié)果見Tab 1。

2.7樣品穩(wěn)定性制備含燈盞乙素苷元濃度分別為391.15、39.12、7.82 μg·L-1的含藥血漿樣品，另制備含燈盞乙素濃度分別為583.92、58.39、11.68 μg·L-1的含藥血漿樣品，考察血漿樣品反復(fù)凍融3次、-20℃放置23 d、室溫放置4 h，按“血漿樣品的處理”方法處理后的分析物放置24 h的穩(wěn)定性，經(jīng)實(shí)測(cè)濃度與加入濃度進(jìn)行比較，燈盞乙素苷元濃度變化在-14.18%~1.09%，燈盞乙素濃度變化在-14.09%~2.62%，表明兩者在上述條件下均穩(wěn)定。

Fig 1　Representative MRM chromatograms of scutellarein and quercetin (IS) in human plasma samples

A： a blank plasma sample；B： a blank plasma sample spiked with scutellarein(C=40 μg·L-1,tR=2.5 min)and IS(C =1600 μg·L-1,tR=2.8 min)；C： plasma sample 9 h after oral administration of 120 mg scutellarin

Tab 1　Precision, accuracy and recovery of scutellarein in human plasma

2.8人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究12名健康男性受試者口服120 mg燈盞花素分散片后，燈盞乙素苷元的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見Fig 2，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見Tab 2。

Fig 2　Mean plasma concentration-time profiles of scutellarein

Tab 2　Main pharmacokinetic parameters of scutellarein

3討論

燈盞乙素及其苷元較不穩(wěn)定，為防止氧化，本實(shí)驗(yàn)于取血前在肝素化試管中加入了維生素C，同時(shí)，在樣品前處理和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中也加入了維生素C。實(shí)驗(yàn)表明加入維生素C可增加樣品穩(wěn)定性。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12]，健康人口服燈盞花素60 mg后，血漿中僅可檢測(cè)到異燈盞乙素和燈盞乙素這兩種β-葡萄糖醛酸苷，未檢測(cè)到硫酸酯共價(jià)結(jié)合物。本文通過(guò)β-葡萄糖醛酸苷酶將血漿中的異燈盞乙素、燈盞乙素全部水解成燈盞乙素苷元進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中使用的β-葡萄糖醛酸苷酶來(lái)自軟體動(dòng)物Helixpomatia，除具有水解β-葡萄糖醛酸苷的活性外，還具有硫酸酯酶活性，即使血漿中存在微量的難以檢測(cè)的硫酸酯共價(jià)結(jié)合物，也可被水解成苷元得到檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)還考察了酶解條件、酶解轉(zhuǎn)化率，酶解穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)以10 kU·mL-1酶液酶解30 min即能達(dá)到高效的酶解作用。血漿中高、中、低3個(gè)濃度燈盞乙素轉(zhuǎn)化為苷元的比率在94.72%~99.80%之間，燈盞乙素苷元酶解過(guò)程中的變化率在-4.63% ~-9.37%之間，表明在本實(shí)驗(yàn)酶解條件下，燈盞乙素幾乎全部轉(zhuǎn)化為苷元，且苷元在酶解過(guò)程中穩(wěn)定，說(shuō)明直接以燈盞乙素苷元為檢測(cè)對(duì)象是合理可行的，該方法能真實(shí)反映燈盞乙素制劑吸收進(jìn)入體內(nèi)的量。

本研究發(fā)現(xiàn)，12名受試者口服燈盞花素分散片120 mg后，燈盞乙素苷元Tmax波動(dòng)較大，且有4名受試者出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，提示燈盞乙素制劑在胃腸道的吸收可能存在肝腸循環(huán)。燈盞乙素苷元Cmax及AUC存在較大個(gè)體差異，可能是因?yàn)椴煌瑐€(gè)體間胃腸道菌群的β-葡萄糖醛酸苷酶活性不同，影響到燈盞乙素轉(zhuǎn)化為苷元的量，而燈盞乙素在胃腸道內(nèi)主要以苷元的形式被吸收，從而導(dǎo)致了不同個(gè)體間Cmax及AUC的差異。

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Pharmacokinetic study of scutellarin in healthy volunteers by

enzymatic hydrolysis and LC-MS-MS analysis

CHU Ji-hong, ZHANG Jun, LI Chang-yin, ZOU Chong, LIU Fang, JU Wen-zheng

(DeptofClinicalPharmacology,AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China)

Key words： scutellarin; scutellarein; β-glucuronidase; enzymatic hydrolysis；LC-MS-MS; pharmacokinetics