徐國旗　華再東　張立蘋　肖紅衛(wèi)　劉西梅　許生成　鄭新民

摘要：為提高卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚胎發(fā)育的能力，探討了雙丁酰基腺苷酸環(huán)化酶（db-cAMP）和卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚胎體外發(fā)育潛力。結(jié)果表明，成熟培養(yǎng)液中分別添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-cAMP時(shí)，卵母細(xì)胞的體外成熟率依次降低，但濃度為1 mmol/L時(shí)的孤雌胚囊胚率（27.03%）顯著高于其他各組（P<0.05）；卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí)，其成熟率、卵裂率及囊胚率（86.00%、89.04%、28.36%）也得到了顯著提高；0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)時(shí)，其成熟率和卵裂率（85.78%和88.95%）與對(duì)照組差異不顯著，但囊胚率（35.14%）顯著提高。0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)能夠顯著提高豬卵母細(xì)胞的體外成熟及孤雌胚胎的發(fā)育潛力。

關(guān)鍵詞：db-cAMP；卵丘細(xì)胞單層；體外發(fā)育；豬

中圖分類號(hào)：S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6303-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.053

Abstract： To improve the developmental potential of pig oocytes in vitro maturation and parthenogenetic embryos， the effects of db-cAMP concentration and cumulus cells monolayer on in vitro maturation and parthenogenetic potential of pig oocytes was investigated. The tests indicated that as the concentration of db-cAMP increased （0、0.5、1.0、1.5 and 2.0 mmol/L）， the maturation rate of oocytes reduced successively. But the blastocyst rate of 1 mmol/L group（27.03%） was significant higher than others（P<0.05）； When oocytes were co-cultured with pig cumulus cell monolayer， the maturation rate、cleavage rate and blastocyst rate（86.00%、 89.04%、 28.36%） were significantly improved. 0.4 mmol/L db-cAMP co-cultured with the monolayer cumulus cell had no significant difference in maturation rate and cleavage rate（85.78% and 88.95%）， but the blastocyst rate（35.14%） were significantly improved. 0.4 mmol/L db-cAMP co-cultured with monolayer cumulus cell can improve the development of parthenogenetic embryos.

Key words：db-cAMP；cumulus cell monolayer；in vitro development；pig

隨著胚胎生物技術(shù)的發(fā)展，豬卵母細(xì)胞體外成熟及發(fā)育能力已成為體外受精（IVF）、胞漿單精子注射（ICSI）和核移植（NT）等技術(shù)成功的關(guān)鍵[1]。然而，目前豬卵母細(xì)胞體外成熟系統(tǒng)并不完善，體外成熟培養(yǎng)時(shí)間較長，許多理化因素直接或間接地影響著卵母細(xì)胞的體外成熟及后期發(fā)育。研究表明，豬的卵母細(xì)胞核在38 h就完成了核的成熟，而胞質(zhì)的成熟則要到42 h左右才能完成，核質(zhì)成熟的不同步可能是影響豬卵母細(xì)胞體外發(fā)育的主要因素[2]。部分卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中能自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂從而使細(xì)胞核成熟，但是細(xì)胞質(zhì)的成熟往往要滯后于核的成熟而導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量差，最終影響后期胚胎的發(fā)育[3]。因此，提高卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量，使其卵母細(xì)胞核、質(zhì)同步成熟，獲得較強(qiáng)的發(fā)育能力，是提高體外胚胎生產(chǎn)效率的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[4，5]。

腺苷酸環(huán)化酶（cAMP）是一種主要由卵丘細(xì)胞分泌產(chǎn)生的核成熟抑制因子，可通過與卵細(xì)胞間隙連接相互影響，從而維持cAMP的水平，提高卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[6，7]。cAMP的水平在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯和恢復(fù)中起著決定性作用，高水平的cAMP能夠阻滯卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂（Germinal vesicle breakdown， GVBD），只有當(dāng)卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平下降到一定程度時(shí)才能啟動(dòng)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂[8]。雙丁酰基腺苷酸環(huán)化酶（db-cAMP）是cAMP類似物，在體外成熟過程中同樣能夠阻滯卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程，在成熟培養(yǎng)液中添加適量db-cAMP，適當(dāng)延緩細(xì)胞核的成熟，達(dá)到核質(zhì)成熟同步，從而可在一定程度上提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量[9]。然而，豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)對(duì)db-cAMP的劑量依賴性較大，其最佳添加濃度還有待進(jìn)一步研究。此外，卵丘細(xì)胞不僅能夠產(chǎn)生大量的cAMP，并且在卵母細(xì)胞生長發(fā)育、體外受精、胚胎發(fā)育等過程中都起著重要作用[10]。目前卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟影響的研究主要集中在卵丘細(xì)胞層數(shù)方面[11]。本試驗(yàn)以屠宰場(chǎng)采集的豬卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，在db-cAMP、卵丘細(xì)胞單層及其共培養(yǎng)時(shí)，研究了卵母細(xì)胞體外成熟及其后期胚胎發(fā)育能力的影響，為優(yōu)化卵母細(xì)胞體外成熟體系提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

除特別標(biāo)識(shí)外，所有化學(xué)試劑均購自Sigma公司（St. Louse，MO，USA）；洗卵液（DPBS）以及TCM-199購自Gibco公司；孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）由寧波激素制品廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 豬卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng) 從當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)采集新鮮卵巢，放入30～37 ℃含青、鏈霉素的生理鹽水中，1.5 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用生理鹽水（37 ℃）沖洗干凈后置于37 ℃水浴鍋中。用配有16號(hào)針頭的10 mL注射器抽吸直徑為3～6 mm的卵泡，收集卵泡液于50 mL的離心管中，靜置10～20 min后，從底部沉淀物中撿取卵丘包裹3層以上的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），經(jīng)添加PVA的DPBS洗滌3遍，再用CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡2 h以上的豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液（TCM-199+3.05 mmol/L葡萄糖+0.91 mmol/L丙酮酸鈉+1 mmol/L L-谷氨酰胺+0.57 mmol/L L-半胱氨酸+10%pFF +10 IU/mL hCG+10 IU/mL PMSG+75 μg/mL青霉素+ 50 μg/mL硫酸鏈霉素）洗滌3遍。將洗好的COCs放在39 ℃、100%濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（20±2） h，隨后轉(zhuǎn)移到無hCG和PMSG的成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)（20±2） h。將擴(kuò)散良好的卵母細(xì)胞用0.1%的透明質(zhì)酸酶反復(fù)吹打數(shù)次脫去顆粒細(xì)胞，再用DPBS洗卵液清洗2～3次，挑選卵母細(xì)胞胞質(zhì)濃稠、卵周間隙明顯、排出第Ⅰ極體的卵母細(xì)胞備用。

1.2.2 豬卵丘細(xì)胞單層的制備 取COCs用0.1%透明質(zhì)酸酶脫去周圍的卵丘細(xì)胞，去除機(jī)械裸卵（DOs） 后將剩下的液體置于1.5 mL離心管中，靜置數(shù)分鐘后吸取中上層液體離心，經(jīng)成熟培養(yǎng)液洗3次后，轉(zhuǎn)移至24孔板（0.5×106～1×106個(gè)/孔）中，置于39 ℃、5% CO2、濕度100%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長成卵丘顆粒細(xì)胞單層時(shí)備用。

1.2.3 孤雌激活 將成熟后脫去卵球的卵母細(xì)胞用融合/激活液（0.25 mol/L甘露醇+0.5 mmol/L 氯化鈣+0.5 mmol/L 硫酸鎂+0.5 mmol/L HEPES+0.01% PVA）洗滌3次，分批放入已經(jīng)鋪滿融合液，電極寬度為1 mm的融合槽（BTX ECM2001電融合儀配套電激活槽）中，用ECM2001（BTX，USA）融合儀施加一個(gè)30 μs，1.3 kv/cm的1次直流電脈沖激活，再用添加4 mg/mL BSA的NCSU-23洗滌3～5次，隨后轉(zhuǎn)入礦物油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液（NCSU-23）中，在39 ℃、5% CO2、濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察并記錄卵裂情況，7～8 d后觀察記錄囊胚發(fā)育情況。

1.2.4 db-cAMP對(duì)卵母細(xì)胞成熟及孤雌胚胎體外發(fā)育的影響 用添加不同濃度db-cAMP（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L）的成熟培養(yǎng)基體外成熟培養(yǎng)22 h后轉(zhuǎn)入無激素及db-cAMP的成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)22 h，統(tǒng)計(jì)第Ⅰ極體排出率，并進(jìn)行孤雌激活，觀察記錄早期胚胎發(fā)育情況。

1.2.5 卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)對(duì)卵母細(xì)胞成熟及孤雌胚胎體外發(fā)育能力的影響 試驗(yàn)分為4組：①對(duì)照組（COCs單獨(dú)培養(yǎng)）；②COCs+卵丘細(xì)胞單層；③機(jī)械裸卵（Dos）+卵丘細(xì)胞單層；④Dos單獨(dú)培養(yǎng)。44 h后統(tǒng)計(jì)第Ⅰ極體排出率，并進(jìn)行孤雌激活，觀察記錄早期胚胎發(fā)育情況。機(jī)械裸卵（Dos）是將成熟培養(yǎng)前選取的COCs用0.1%透明質(zhì)酸酶脫除包裹在其周圍的卵丘細(xì)胞得到。

1.2.6 db-cAMP與卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)卵母細(xì)胞成熟及孤雌胚胎體外發(fā)育潛力的影響 選取最適濃度的db-cAMP添加到成熟培養(yǎng)基與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)22 h，隨后轉(zhuǎn)入到無激素及db-cAMP的成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)22 h，統(tǒng)計(jì)第Ⅰ極體排出率，并進(jìn)行孤雌激活，隨后觀察記錄早期胚胎發(fā)育情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用卡方方法進(jìn)行分析檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 COCs細(xì)胞及胚胎發(fā)育情況

撿取卵丘包裹3層以上的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）（圖1A）進(jìn)行體外培養(yǎng)44 h。挑選卵母細(xì)胞胞質(zhì)濃稠、卵周間隙明顯、排出第Ⅰ極體的卵母細(xì)胞激活，激活后的卵母細(xì)胞如圖1B所示。然后在39 ℃、5% CO2、濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察并記錄卵裂情況如圖1C所示；7～8 d后觀察記錄囊胚發(fā)育情況如圖1D所示。

2.2 不同db-cAMP濃度對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

卵母細(xì)胞在添加了不同濃度db-cAMP的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)22 h后，轉(zhuǎn)入不含db-cAMP和激素的成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)22 h。結(jié)果表明，豬卵母細(xì)胞成熟率隨著db-cAMP濃度增加呈降低趨勢(shì)。與對(duì)照組（71.37%）相比，濃度為0.5、1.0 mmol/L時(shí)的成熟率（69.57%和67.15%）差異不顯著 （P >0.05）（表1），而濃度為1.5、2.0 mmol/L時(shí)（49.56%和34.30%）顯著降低（P<0.05）。

孤雌激活后觀察卵裂及囊胚發(fā)育情況，1 mmol/L組的卵裂率顯著高于2 mmol/L和3 mmol/L組（P<0.05），而與對(duì)照組及0.5 mmol/L組間差異不顯著（P>0.05），但其囊胚率顯著高于其他各組（P<0.05）（表1）。

2.3 卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

由表2可以看出，在以卵丘細(xì)胞單層為飼養(yǎng)層的情況下，COCs經(jīng)44 h成熟培養(yǎng)后成熟率、卵裂率、囊胚率均顯著高于其他各組（P<0.05）。與對(duì)照組相比，機(jī)械裸卵在有或無卵丘細(xì)胞單層時(shí)的成熟率、卵裂率、囊胚率都顯著降低（P<0.05），但卵丘細(xì)胞單層能顯著提高機(jī)械裸卵的成熟率及后期胚胎發(fā)育能力（P<0.05）。

2.4 db-cAMP與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

選取1 mmol/L的db-cAMP為最適添加濃度，與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)，結(jié)果（表3）表明，當(dāng)在共培養(yǎng)組中添加db-cAMP時(shí)卵母細(xì)胞的體外成熟率、卵裂率以及囊胚率（62.79%、71.96%和18.38%）都顯著降低（P<0.05）。濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L db-cAMP與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)，卵母細(xì)胞體外成熟率隨濃度增加呈遞減趨勢(shì)，但0.4 mmol/L db-cAMP與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)時(shí)，囊胚率最高（35.14%）。

3 小結(jié)與討論

核質(zhì)成熟不同步往往是影響卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量的主要因素，而卵母細(xì)胞內(nèi)高水平cAMP可阻滯減數(shù)分裂的恢復(fù)，在一定程度上抑制核的成熟，從而達(dá)到核質(zhì)成熟的同步化[9]。本試驗(yàn)通過添加一定劑量的核成熟抑制因子類似物db-cAMP來延遲核的成熟，力求達(dá)到核質(zhì)同步成熟，提高體外胚胎質(zhì)量。結(jié)果表明，db-cAMP對(duì)卵母細(xì)胞核成熟的抑制作用具有明顯的劑量依賴性。隨著劑量的增加，卵母細(xì)胞的成熟率呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，然而添加劑量為0.5和1.0 mmol/L時(shí)，成熟率的降低并不影響后續(xù)胚胎發(fā)育的卵裂率及囊胚率，添加1.0 mmol/L的db-cAMP能顯著提高孤雌胚胎的后期發(fā)育能力。這與Zhao等[12]關(guān)于體外添加db-cAMP能顯著提高囊胚率的報(bào)道一致。

研究表明，卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）中cAMP主要來源于卵丘細(xì)胞，并通過與卵母細(xì)胞間的間隙連接運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中[7]，因此COCs中總的cAMP水平在一定程度上取決于卵丘細(xì)胞的數(shù)量。此外，卵丘細(xì)胞能將卵泡液中的胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?，有助于卵母?xì)胞對(duì)半胱氨酸的獲取，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟[13]。如果兩者間縫隙連接被過早破壞 ，卵母細(xì)胞可能停止發(fā)育[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，COCs與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)能顯著提高卵母細(xì)胞成熟率及后期胚胎發(fā)育能力。將脫去卵丘后的機(jī)械裸卵與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)時(shí)能夠極大地提高其體外成熟能力，這可能是由于裸卵不能直接利用葡萄糖，而卵丘細(xì)胞能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為丙酮酸而被裸卵利用，從而為卵母細(xì)胞的生長和發(fā)育提供能量。此外，裸卵緊貼于卵丘細(xì)胞上，可能與卵丘細(xì)胞形成正常的間隙鏈接，或通過旁分泌，產(chǎn)生一些促卵細(xì)胞成熟因子，提高卵母細(xì)胞的成熟率及胚胎質(zhì)量[15]。

本研究中，筆者設(shè)想通過添加適量的db-cAMP與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)來提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，然而結(jié)果表明，當(dāng)卵母細(xì)胞在添加1 mmol/L db-cAMP的成熟培養(yǎng)液中與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)時(shí)，成熟率及卵裂率都大大降低。這可能是卵丘細(xì)胞單層產(chǎn)生了足夠的cAMP，調(diào)節(jié)核質(zhì)的成熟，再加入其類似物，其含量總和超過了最適抑制濃度，因而阻滯了卵母細(xì)胞的正常成熟。選取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L db-cAMP幾個(gè)濃度與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)，結(jié)果表明，0.4 mmol/L db-cAMP與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)時(shí)，囊胚率得到了顯著性提高。

綜上所述，cAMP對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟和胚胎早期發(fā)育影響重大，1 mmol/L db-cAMP或0.4 mmol/L db-cAMP與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)時(shí)，能夠較好地調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞核質(zhì)的同步成熟，從而在一定程度上提高孤雌胚胎早期發(fā)育能力。然而，0.4 mmol/L db-cAMP與卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)時(shí)的囊胚率顯著高于其他各組，這可能是由于卵丘細(xì)胞能夠產(chǎn)生某些其他因子，從而促進(jìn)了卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟，有助于核質(zhì)成熟同步化，其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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