脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)維甲酸X受體基因克隆及其在溫鹽脅迫和蛻皮周期中的表達(dá)分析*

柳 飛 李 健 李吉濤 葛倩倩 連春盎 常志強(qiáng)

(1. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266235)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名白蝦、迎春蝦等, 屬于十足目(Decapoda), 長(zhǎng)臂蝦科(Palaemon), 白蝦屬(Exopalaemon), 系熱溫帶海水底棲蝦類(lèi)(劉瑞玉, 1955), 在我國(guó)沿海均有分布, 尤以黃、渤海產(chǎn)量最高(李新正等, 2003)。近年來(lái), 隨著中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)等傳統(tǒng)蝦類(lèi)養(yǎng)殖難度的日益加大, 以及沿海灘涂養(yǎng)殖的不斷擴(kuò)大, 脊尾白蝦以其生長(zhǎng)速度快、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn), 已成為重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種(張振華等, 2002; 王興強(qiáng)等,2005)。蛻皮貫穿著水生甲殼類(lèi)的整個(gè)生活史, 與其生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和附肢再生等密切相關(guān), 水生甲殼類(lèi)蛻皮發(fā)生影響關(guān)鍵因素及其調(diào)控機(jī)制一直是人們研究的重點(diǎn)(李旭光等, 2014)。影響甲殼動(dòng)物蛻皮發(fā)生的因素有很多, 一方面受內(nèi)源因子(蛻皮激素、蛻皮激素受體與維甲類(lèi)X受體等)調(diào)控, 另一方面受外源因子(溫度、鹽度、鈣離子等)影響(Buchholzet al,2010)。

維甲酸X受體(retinoid X receptor, RXR)屬于核受體超家族成員, 是一種重要的調(diào)控因子, 對(duì)甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖具有十分重要的作用(卜文等,1994)。RXR基因發(fā)揮作用一般是與蛻皮激素核受體(ecdysone receptor, ECR)形成 RXR-ECR二聚體, 共同調(diào)控下游基因(E74, E75)的轉(zhuǎn)錄, 從而對(duì)生長(zhǎng)和蛻皮過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)(Riddifordet al, 2003; Kimet al, 2005;Techaet al, 2013)。RXR在結(jié)構(gòu)上一般可分為A—F六個(gè)區(qū), 形成四個(gè)獨(dú)立的功能區(qū)。其中以C區(qū)和E區(qū)最為保守。A/B區(qū)為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域保守性較低; C區(qū)為DNA結(jié)合區(qū)(DBD), 含兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu);E/F區(qū)則含配體結(jié)合區(qū)(LBD); D區(qū)作為鉸鏈連接DBD和LBD (Duricaet al, 2002; Devarakondaet al,2003)。Asazuma等(2007)在對(duì)日本囊對(duì)蝦的研究中發(fā)現(xiàn), 蛻皮激素受體 EcR在 Y器官中的表達(dá)量顯著高于其它組織, 而RXR是通過(guò)與EcR形成二聚體共同調(diào)節(jié)甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)和蛻皮過(guò)程, 所以說(shuō)明 RXR基因參與了蛻皮的調(diào)控過(guò)程。在羅氏沼蝦的研究中發(fā)現(xiàn),RXR基因的DNA結(jié)合區(qū)與昆蟲(chóng)的RXR基因的DNA結(jié)合區(qū)相似度極高, 表明了 RXR基因較高的保守性(Asazumaet al, 2007)。在王偉等(2014)在對(duì)三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)RXR基因研究中表明,RXR基因在各組織中均有所表達(dá), 在 Y器官和眼柄中表達(dá)量較高; 在不同的蛻皮階段各組織的表達(dá)規(guī)律有所差異, 表明了 RXR對(duì)蛻皮發(fā)生具有一定的調(diào)控作用。

近年來(lái), 隨著脊尾白蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷發(fā)展, 脊尾白蝦的養(yǎng)殖和繁殖技術(shù)日漸成熟。梁俊平等(2012)對(duì)脊尾白蝦全人工繁育技術(shù)進(jìn)行了相關(guān)研究, 明確了幼體孵化、培育的適宜溫度和鹽度范圍。栗治國(guó)(2013)對(duì)脊尾白蝦繁殖生物學(xué)、胚胎發(fā)育、幼體發(fā)育及主要環(huán)境因子對(duì)其早期發(fā)育的影響進(jìn)行了研究,并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展了脊尾白蝦工廠化育苗技術(shù)研究。但對(duì)于脊尾白蝦蛻皮機(jī)理的研究較少, 脊尾白蝦RXR基因在其蛻皮過(guò)程中的作用尚不清楚。本文通過(guò)RACE技術(shù)克隆脊尾白蝦RXR基因cDNA全長(zhǎng),利用實(shí)時(shí)定量 PCR分析該基因在脊尾白蝦各組織中的表達(dá)分布及在蛻皮周期中的表達(dá)規(guī)律, 研究其在溫度和鹽度脅迫后鰓和肝胰腺組織中的表達(dá)模式,研究結(jié)果將為脊尾白蝦RXR基因的功能及蛻皮調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)脊尾白蝦由日照海辰水產(chǎn)有限公司提供,挑選活力較好, 個(gè)體較一致的脊尾白蝦作為試驗(yàn)用蝦。平均體長(zhǎng)為(3.5 ± 0.3)cm。

試驗(yàn)在200L的白色PVC水族箱內(nèi)進(jìn)行, 試驗(yàn)水體為 100L, 每天投喂基礎(chǔ)飼料早晚各一次, 沙濾自然海水, 水溫(16 ± 0.5)°C, 每天保持充氣, 鹽度為29,pH 8.1。每天吸污并換水, 暫養(yǎng)7天后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溫度、鹽度梯度的設(shè)置 每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)組, 每個(gè)重復(fù)放置36尾蝦并設(shè)置對(duì)照組, 連續(xù)充氣增氧, 實(shí)驗(yàn)期間不投餌。溫度脅迫實(shí)驗(yàn)的海水鹽度為29并以16°C為對(duì)照組; 鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)水溫設(shè)為16°C并以29的鹽度作為對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置如表1所示)。

表1 溫度、鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)計(jì)Tab.1 Design of the gradient in temperature and salinity

1.2.2 樣品采集與處理 在溫度、鹽度脅迫后0、3、6、12、24、48、72h分別從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取4尾蝦。血淋巴的采集： 0.5mL預(yù)冷的抗凝劑(4°C)與0.5mL血淋巴, 配置成抗凝血, (4°C, 3000r/min) 10min, 離心后去掉上清液, 向離心管中加入 1mL Trizol(使用方法按照 Invitrogen說(shuō)明書(shū)操作)置于-80 °C超低溫冰箱保存。鰓、肝胰腺、胃、腸、肌肉、眼柄6種組織分別用液氮研磨, 天平稱(chēng)取 0.05g樣品后加入含有1mL Trizol的 1.5mL離心管中, 震蕩混勻后放入-80°C冰箱中保存用于后續(xù)總RNA的提取。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 脊尾白蝦RXR基因cDNA片段的克隆參照GenBank上公布的RXR基因序列： 中國(guó)對(duì)蝦(F. chinensis) (FJ194479)、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense) (KC460323)、日本囊對(duì)蝦(M. japonicas) (AB295493)、美洲龍蝦(Homarus americanus) (KC409355)、招潮蟹(Celuca pugilator)(AF032983), 用 DNAMAN軟件進(jìn)行序列對(duì)比, 在保守度較高的區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物 RXR-F、RXR-R(如表2所示), 實(shí)驗(yàn)所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司負(fù)責(zé)合成。

表2 實(shí)驗(yàn)用PCR引物及序列Tab.2 Primers and their sequences used in the experiment

1.2.4 脊尾白蝦總RNA提取及cDNA的合成 取出超低溫冰箱中保存的樣品, 并按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總 RNA, 用核酸定量?jī)x(Thermo Scientific)檢測(cè) RNA的產(chǎn)量與純度, 使用 1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA的完整性。按照 M-MLV Promega說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄, 合成 cDNA第一鏈。中間片段擴(kuò)增反應(yīng)體系如下(10μL)： 無(wú)菌水 6.85μL, cDNA 0.5μL(肝胰腺), 10×PCR buffer 1μL, dNTP Mixture 0.8μL,proPOF 0.4μL, proPOR 0.4μL, Taq DNA 聚合酶0.05μL。PCR反應(yīng)程序參照本實(shí)驗(yàn)室通用程序進(jìn)行(王蕓等, 2011; 李洋等, 2014), 引物退火溫度經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化為 50°C。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果以及片段大小, 使用 DNA 膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行膠回收與純化, 純化產(chǎn)物與 pMD18-T載體進(jìn)行連接, 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞, 經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后挑選陽(yáng)性克隆, 經(jīng) PCR驗(yàn)證后由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 EcRXR基因的3′RACE和5′RACE擴(kuò)增 按照Clontech公司的SMAR-TTM-RACE cDNA試劑盒的使用說(shuō)明, 合成用于 3′、5′ RACE 擴(kuò)增的 cDNA; 以測(cè)序所得 EcRXR 基因中間片段為模板設(shè)計(jì) 3′和 5′RACE所需引物(見(jiàn)表1), 以鰓和肝胰腺的混合RNA為模板, 按照 SMARTTMRACE試劑盒說(shuō)明的反應(yīng)條件與體系進(jìn)行3′和5′RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序等按中間片段步驟進(jìn)行。

1.2.6 序列分析 采用 DNAStar對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行載體序列的去除和目的序列的拼接; 采用 Blast程序分析EcRXR基因與其它物種RXR基因的同源性和一致性; 利用DNAMAN進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)的翻譯, 利用SMART和Interpro Scan軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)功能域及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)與分析, 分別用DNAMAN和 MEGA進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.2.7 蛻皮周期實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)用脊尾白蝦暫養(yǎng)一周后, 挑選肢體健全、活力較好的個(gè)體用, 用解剖剪剪取尾節(jié)末端, 腹面向上置于加有清水的干凈載玻片上, 用Nikon(ECLIPSE Ti-U)倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。根據(jù)脊尾白蝦尾節(jié)剛毛基質(zhì)、剛毛腔、剛毛圓錐、上皮細(xì)胞的變化將蛻皮過(guò)程進(jìn)行分期(都威等, 1997; 王戰(zhàn)芳, 2014)。分別在蛻皮前期(D期, 各亞期持續(xù)時(shí)間較短以典型特征的D2亞期)、蛻皮后期(AB期)、蛻皮間期(C期)進(jìn)行取樣, 將取好的鰓、肝胰腺、胃、腸、表皮、眼柄放入液氮保存待用。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR) 首先將cDNA模板梯度稀釋進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增, 確定最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。按照 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作, 反應(yīng)體系如表 3所示。以各實(shí)驗(yàn)組脊尾白蝦組織總 RNA為模板, 合成cDNA。將樣品在混勻后加入 96孔 PCR(Axygen)板中, 瞬時(shí)離心后放入熒光定量PCR儀(ABI 7500)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)程序?yàn)椋?95°C預(yù)變性30s; 循環(huán)條件為95°C 5s, 60°C 34s, 共40個(gè)循環(huán); 熔解曲線條件為 95°C 15s, 60°C 1min, 95°C 15s, 60°C 15s。內(nèi)參基因采用脊尾白蝦18S rRNA, 引物序列如表2所示(段亞飛等, 2013), 每個(gè)樣品及內(nèi)參基因進(jìn)行三個(gè)重復(fù), 反應(yīng)完成后, 采用Real-time PCR (SYBR Green)2-ΔΔCt相對(duì)定量方法進(jìn)行計(jì)算。

表3 EcRXR與18S rRNA基因熒光定量PCR反應(yīng)體系中各試劑用量(μL)Tab.3 The volume (μL) of each reagent added to the PCR mixture used for qRT-PCR of EcRXR and 18S rRNA

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差以(ˉx ±SD)表示, 采用SPSS17.0進(jìn)行單因子方差分析, 并進(jìn)行Duncan氏多重比較, 當(dāng)P＜0.05時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EcRXR cDNA全長(zhǎng)克隆及序列分析

以脊尾白蝦鰓、肝胰腺組織的總RNA混合物為模板, 反轉(zhuǎn)錄得到3′RACE和5′RACE的cDNA第一鏈, RACE克隆后得到710bp和626bp的兩段cDNA序列。將兩個(gè)序列與中間片段進(jìn)行拼接, 得到脊尾白蝦 RXR基因 cDNA全長(zhǎng)序列, 命名為 EcRXR,GenBank登錄號(hào)： KU647675。該基因cDNA序列全長(zhǎng)為 1323bp, 其中, 開(kāi)放閱讀框(ORF)855bp, 5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)37bp, 3′非編碼區(qū)(3′-UTR)433bp。對(duì)EcRXR基因分析可知, 其編碼一個(gè)由 284個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì), 分子量為 30.918kDa, 理論等電點(diǎn)為pI為6.79。通過(guò)軟件進(jìn)一步分析表明, 該蛋白不存在信號(hào)肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū), 說(shuō)明該基因編碼的蛋白不屬于分泌蛋白。經(jīng)BLASTn、BLASTx以及多序列比對(duì)表明, 此氨基酸序列與日本沼蝦(M. nipponense)、褐蝦(Crangon crangon)與美洲鰲龍蝦(H. americanus)等的氨基酸序列具有很高的同源性, 可進(jìn)一步確定此序列為脊尾白蝦RXR序列。EcRXR基因從N端到C端具有 4個(gè)典型的結(jié)構(gòu)功能域： A/B域(轉(zhuǎn)錄激活域)、C域(DNA 結(jié)合域, DBD)、D 域(鉸鏈域)、E/F域(配體結(jié)合域, LBD), 與三疣梭子蟹(王偉等, 2014)和中華絨螯蟹(王瑤等, 2013)RXR基因具有相同的結(jié)構(gòu)域。C域中存在 P-box和 D-box, D域中存在T-box(如圖1所示)。通過(guò)與氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 維甲酸 X受體基因的特定結(jié)構(gòu)域在幾個(gè)物種中都存在,脊尾白蝦E/F域較其它物種有部分序列缺失(圖2)。

脊尾白蝦 RXR氨基酸序列與日本沼蝦(M.nipponense)、褐蝦(C. crangon)與美洲鰲龍蝦(H.americanus)一致性分別為 90%、89%、83%, 與凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)、中國(guó)對(duì)蝦(F. chinensis)和招潮蟹(C. pugilator)一致性分別為 76%、75%和71%。利用 MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,與甲殼動(dòng)物的 RXR聚為一支, 其中脊尾白蝦與日本沼蝦單獨(dú)聚為一支, 表明其親緣性最高(圖3)。

圖1 EcRXR基因cDNA全長(zhǎng)及預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.1 Full cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of EcRXR

圖2 脊尾白蝦與其它甲殼動(dòng)物的RXR氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Comparison of amino acid sequences of RXR between E. carinicauda and other crustacean species

2.2 EcRXR基因組織表達(dá)分析

2.2.1 EcRXR基因的組織表達(dá)分布 對(duì)脊尾白蝦EcRXR基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR分析, 可以得出： EcRXR基因在血淋巴、鰓、肝胰腺、胃、腸、肌肉、表皮、眼柄中均有表達(dá)。在眼柄中 EcRXR基因的表達(dá)量最高, 鰓、胃、腸、表皮的表達(dá)量次之, 而在肝胰腺、肌肉、血淋巴表達(dá)量很低(如圖4所示)。

圖3 RXR氨基酸序列的NJ進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The neighbor-joining phylogenetic tree for RXRs

圖4 脊尾白蝦RXR在各組織中的表達(dá)情況Fig.4 Relative expression of E. carinicauda RXR gene in different tissues

2.2.2 EcRXR基因在不同蛻皮周期中的表達(dá)分析根據(jù) EcRXR基因在各組織中的表達(dá)分布情況, 選擇鰓、肝胰腺、胃、腸、表皮和眼柄6個(gè)組織, 研究EcRXR基因在不同蛻皮周期中的表達(dá)情況如圖5所示。研究結(jié)果表明, 在不同的蛻皮階段EcRXR基因在6種組織中的表達(dá)量差異顯著(P＜0.05)。在鰓中, 間期的表達(dá)量最高, 前期EcRXR基因的表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降, 后期EcRXR基因的表達(dá)量出現(xiàn)顯著上升(P＜0.05)。在肝胰腺、胃、腸、眼柄中EcRXR基因的表達(dá)具有相似的變化規(guī)律, 間期表達(dá)量最低, 在前期表達(dá)量顯著上升(P＜0.05), 后期表達(dá)量繼續(xù)顯著上升(P＜0.05)。而在表皮中與上述三種組織中的表達(dá)情況正好相反, 間期表達(dá)量最高, 前期后期均顯著下降(P＜0.05)。

圖5 RXR在不同蛻皮時(shí)期脊尾白蝦6個(gè)組織中的表達(dá)情況Fig.5 Relative expression of RXR in six tissues from E.carinicauda of different molting stages

2.2.3 EcRXR基因在溫度脅迫中的表達(dá)分析 脊尾白蝦溫度脅迫后, 鰓中 EcRXR基因的相對(duì)表達(dá)量如圖 6所示。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比較, 在低溫脅迫后,EcRXR基因表達(dá)量在3h時(shí)輕微上調(diào), 6h時(shí)有所下調(diào),12h時(shí)達(dá)到最大值, 相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的 2.32倍,24h時(shí)表達(dá)量顯著降低達(dá)到最低值, 72h逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平。21°C脅迫組, 在3h時(shí)表達(dá)量顯著降低,6—24h逐漸升高, 到24h達(dá)到最大值, 48h時(shí)顯著降低, 72h恢復(fù)至對(duì)照組水平。26°C高溫脅迫組, 在6h時(shí)表達(dá)量顯著降低, 12h顯著升高達(dá)到最大值, 24h降低到最低值48—72h相對(duì)表達(dá)量升高后又有所下降。

圖6 溫度脅迫下脊尾白蝦鰓中RXR基因的表達(dá)情況Fig.6 Expression of RXR gene in E. carinicauda gill tissue under temperature stress

溫度脅迫后, 脊尾白蝦肝胰腺中 EcRXR基因的相對(duì)表達(dá)量如圖7所示。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比較, 在低溫脅迫后, EcRXR基因表達(dá)量在3—12h時(shí)逐漸上升,12h時(shí)達(dá)到最大值, 24h時(shí)表達(dá)量顯著降低, 48h顯著上升, 72h逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平。21°C脅迫組, 在3h時(shí)顯著升高, 6h有所降低, 到12—24h時(shí)顯著升高,24h達(dá)到最高值, 72h恢復(fù)至對(duì)照組水平。26°C高溫脅迫組, 在3h時(shí)表達(dá)量升高, 6—12h表達(dá)量較低, 24h達(dá)到最大值, 48h后相對(duì)表達(dá)量逐漸降低, 在72h時(shí)顯著高于對(duì)照組。

圖7 溫度脅迫下脊尾白蝦肝胰腺中RXR基因的表達(dá)情況Fig.7 Expression of RXR gene in E. carinicauda hepatopancreas tissue under temperature stress

2.2.4 EcRXR基因在鹽度脅迫中的表達(dá)分析 溫度脅迫后, 脊尾白蝦鰓中 EcRXR基因的相對(duì)表達(dá)量如圖8所示。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比較, 11的低鹽脅迫后,3—12h相對(duì)表達(dá)量逐漸升高, 12h達(dá)到最大值,24—72h逐漸降低, 72h時(shí)顯著低于對(duì)照組。20的中低鹽度脅迫后, 3h時(shí)表達(dá)量上升, 6—24h逐漸降低且保持在較低范圍, 48h顯著升高, 72h有所降低并顯著高于對(duì)照組。38的高鹽脅迫后, 3h表達(dá)量升高,6—12h表達(dá)量上升, 24—72h逐漸降低并顯著低于對(duì)照組。

圖8 鹽度脅迫下脊尾白蝦鰓中RXR基因的表達(dá)情況Fig.8 Expression of RXR gene in E. carinicauda gill tissue under salinity stress

溫度脅迫后, 脊尾白蝦肝胰腺中的 EcRXR基因相對(duì)表達(dá)量如圖9所示。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比較, 11的鹽度脅迫后, 3h相對(duì)表達(dá)量升高, 后逐漸降低, 48h達(dá)到最低值, 72h時(shí)恢復(fù)對(duì)照組水平。20的中低鹽度脅迫后, 3h時(shí)表達(dá)量上升, 6h達(dá)到最高值, 12—24h逐漸降低, 24h達(dá)到最低值, 48h顯著升高, 到72h恢復(fù)對(duì)照組水平。38的高鹽脅迫后, 3—12h表達(dá)量上升, 12h達(dá)到最高值, 24h降低到最低水平, 48h上高后趨于穩(wěn)定。

圖9 鹽度脅迫下脊尾白蝦肝胰腺中RXR基因的表達(dá)情況Fig.9 Expression of RXR gene in E. carinicauda hepatopancreas tissue under salinity stress

3 討論

維甲酸 X受體是核受體家族中重要的一員, 可與多種其它核受體如維甲酸受體(RAR)、甲狀腺激素受體(TR)和維生素D受體(VDR)等形成二聚體作為轉(zhuǎn)錄因子, 參與動(dòng)物個(gè)體發(fā)育、代謝、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞凋亡等眾多生理學(xué)過(guò)程(卜文等, 1994;李維等, 2013)。本研究克隆得到全長(zhǎng)為1323bp的維甲酸X受體基因EcRXR。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明EcRXR存在RXR基因的典型的結(jié)構(gòu)域, 可以確定為RXR基因。進(jìn)化樹(shù)分析表明其與甲殼動(dòng)物聚為一支,日本沼蝦單獨(dú)聚為一支, 表明本研究克隆得到的RXR基因確定為脊尾白蝦RXR基因。

甲殼動(dòng)物的蛻皮發(fā)生貫穿整個(gè)生命周期, 與其生長(zhǎng)、發(fā)育及繁殖息息相關(guān), 甲殼動(dòng)物的蛻皮是由神經(jīng)和內(nèi)分泌間協(xié)調(diào)作用, 以及外源因子的干擾作用等共同決定蛻皮周期的長(zhǎng)短, 影響生長(zhǎng)發(fā)育。維甲酸X受體屬于核受體超家族成員, 是一種重要的內(nèi)源調(diào)控因子, 對(duì)甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)、繁殖起重要作用(Ahujaa et al, 2003; Mark et al, 2009)。甲殼類(lèi)蛻皮激素的作用靶標(biāo)是核受體家族成員蛻皮激素受體(ECR)和維甲酸X受體(RXR)組成, 蛻皮激素受體與維甲酸 X受體(ECR/RXR)位于甲殼類(lèi)蛻皮周期過(guò)程中信號(hào)通路調(diào)控的上游端, 是參與調(diào)控蛻皮過(guò)程的關(guān)鍵基因(Riddiford et al, 2003; 李旭光等, 2014)。目前為止,已對(duì)日本沼蝦(M. nipponensis) (Asazuma et al, 2007)、凡納濱對(duì)蝦(L. vannamei) (蔣丹, 2010)、中華絨螯蟹(E.sinensis) (王瑤等, 2013)、藍(lán)蟹(C. sapidus) (Techa et al,2013)、三疣梭子蟹(P. trituberculatus) (王偉等, 2014)等物種的維甲酸X受體基因已經(jīng)有所研究, RXR基因在不同甲殼動(dòng)物組織中的表達(dá)量有所差異, 在各蛻皮周期中表達(dá)也有所差異。在對(duì)日本沼蝦、日本囊對(duì)蝦、陸地蟹等物種的研究中發(fā)現(xiàn), RXR基因在性腺中具有較高的表達(dá)量, 由此推測(cè) RXR基因不僅與蛻皮相關(guān), 還與性腺發(fā)育與繁殖相關(guān)(Durica et al, 1996)。

實(shí)驗(yàn)組織熒光定量表達(dá)結(jié)果顯示, EcRXR基因在血淋巴、鰓、肝胰腺、胃、腸、表皮、眼柄中均有表達(dá), 在眼柄中表達(dá)量最高, 說(shuō)明眼柄是該基因的主要調(diào)控器官。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 眼柄中的 EcRXR在后期表達(dá)量最高, 間期表達(dá)量最低, 表明眼柄中的內(nèi)分泌細(xì)胞的增殖分化主要在后期(Chang et al, 2011); 肝胰腺、胃、腸中, 與間期相比, 前期后期表達(dá)量逐漸上升, 后期表達(dá)量最高, 表明肝胰腺、胃、腸中細(xì)胞的增殖分化主要發(fā)生在蛻皮后期, 肝胰腺間期表達(dá)量最低, 也表明肝胰腺中的脂類(lèi)營(yíng)養(yǎng)代謝過(guò)程不是由EcRXR調(diào)控的。

溫度是影響甲殼類(lèi)蛻皮過(guò)程重要的環(huán)境因子。在適當(dāng)?shù)臏囟确秶鷥?nèi), 較高的溫度能夠提高體內(nèi)酶的活性, 加速代謝過(guò)程, 促進(jìn)蛻皮發(fā)生頻率, 促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。鰓和肝胰腺是蝦蟹類(lèi)的主要呼吸和代謝器官,溫度能影響呼吸代謝相關(guān)的酶活性進(jìn)而影響其生命活動(dòng)(李旭光等, 2014)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)置不同的溫度梯度, 研究其對(duì) EcRXR基因在鰓和肝胰腺的表達(dá)的規(guī)律。研究結(jié)果表明, 溫度脅迫后鰓中 EcRXR基因表達(dá)總體上呈現(xiàn)先降低后升高, 再降低后升高至正常水平; 肝胰腺中 EcRXR表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低,再升高后降低的變化趨勢(shì)。鰓和肝胰腺在溫度脅迫下EcRXR基因表達(dá)發(fā)生顯著的調(diào)控過(guò)程, 這說(shuō)明EcRXR不僅參與了蛻皮過(guò)程也參與了脊尾白蝦體內(nèi)酶活性的調(diào)控作用, 印證了維甲酸信號(hào)通路中關(guān)于酶活性的調(diào)控作用(Evans et al, 1999)。

鹽度是影響水生甲殼類(lèi)的蛻皮發(fā)生的另一個(gè)關(guān)鍵影響因子, 在一定范圍內(nèi)的鹽度變化能夠加速蛻皮過(guò)程的進(jìn)行, 鹽度過(guò)低或過(guò)高, 都會(huì)影響甲殼類(lèi)的蛻皮周期時(shí)間與蛻皮頻率(李旭光等, 2014)。水生甲殼動(dòng)物為了適應(yīng)水中滲透壓的變化, 通過(guò)內(nèi)分泌調(diào)控系統(tǒng)第二信使環(huán)狀腺苷酸(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)、鈣調(diào)節(jié)蛋白(CaM)等激活Na+/K+泵和Cl-離子通道, 對(duì)體內(nèi)滲透壓進(jìn)行調(diào)控(Zanotto et al, 2002)。鰓是水生甲殼動(dòng)物呼吸的重要器官, 能夠?qū)w內(nèi)滲透壓和離子平衡進(jìn)行有效調(diào)節(jié)(韓曉琳等, 2014), 肝胰腺也參與了部分離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。本研究在不同鹽度脅迫后發(fā)現(xiàn), EcRXR基因表達(dá)呈現(xiàn)規(guī)律性變化。鰓中EcRXR總體呈現(xiàn)先升高在降低的變化趨勢(shì); 肝胰腺中EcRXR呈現(xiàn)先升高在降低后升高在降低到對(duì)照組水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, EcRXR基因除了對(duì)脊尾白蝦蛻皮過(guò)程起調(diào)控作用外, 還參與了脊尾白蝦體內(nèi)滲透壓的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)引物, 克隆了脊尾白蝦 EcRXR基因cDNA序列全長(zhǎng), 分析了EcRXR基因在脊尾白蝦組織和蛻皮周期的表達(dá)規(guī)律, 并探究了在溫度、鹽度脅迫過(guò)程的中的表達(dá)模式。研究結(jié)果表明 EcRXR基因在脊尾白蝦蛻皮、酶活性調(diào)控、滲透壓調(diào)節(jié)中都發(fā)揮了重要的作用, 進(jìn)一步推測(cè)EcRXR可能是溫度、鹽度影響脊尾白蝦蛻皮的重要調(diào)控因子之一, 為深入研究RXR在脊尾白蝦和其它甲殼動(dòng)物蛻皮機(jī)制中的功能提供了重要信息。

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