杜常青++劉小偉++曾廣忠++金紅峰++黃敬桓++唐禮江

[摘要] 目的探討抑制法尼基焦磷酸合成酶對(duì)改善2型糖尿病大鼠左心室重構(gòu)與心功能的影響。方法采用高脂高糖飲食加一次性腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ 30mg/kg）建立2型糖尿病模型。健康雄性SD大鼠30只隨機(jī)分成正常對(duì)照組（control組，n=10）、糖尿病組（DM組，n=10）、糖尿病+伊班膦酸鈉組（DM+IB組，n=10）。建模成功后DM+IB組SD大鼠連續(xù)16周每天皮下注射5微克，千克劑量伊班膦酸鈉溶液，control和DM組大鼠在相同位置注射相等劑量的0.9%氯化鈉注射液。實(shí)驗(yàn)21周后分別對(duì)3組SD大鼠行心臟超聲和血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定，HE染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)橫截面大小，Masson復(fù)合染色檢測(cè)心肌組織膠原纖維沉積程度。結(jié)果與對(duì)照組相比，DM組大鼠左心室內(nèi)徑增大、室間隔及左心室后壁顯著增厚、心功能降低、心肌細(xì)胞明顯肥大、心肌間質(zhì)及心肌血管周圍膠原纖維沉積顯著增多（P<0.01）； DM+IB組大鼠雖出現(xiàn)上述結(jié)構(gòu)及功能改變，但與DM組相比上述情況均有明顯改善（P<0.05）。結(jié)論抑制法尼基焦磷酸合成酶在一定程度上可改善糖尿病心肌病大鼠左室重構(gòu)與心臟功能。

[關(guān)鍵詞]糖尿病心肌病；法尼基焦磷酸合成酶；伊班膦酸鈉；左心室重構(gòu)

中圖分類號(hào)：R587.1； R445.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-816X（2015）03-0183-05

糖尿病心肌?。―iabetic Cardiomyopathy，DCM）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其病理表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix，ECM）沉積和心肌間質(zhì)纖維化。法尼基焦磷酸合成酶（Farnesyl Py- rophosphate Synthase，，F(xiàn)PPS是甲羥戊酸途徑關(guān)鍵酶之一?，F(xiàn)有研究表明，F(xiàn)PPS在心臟重構(gòu)中扮演著重要作用，F(xiàn)PPS在自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously Hyper- tensive Rats' SHR）心臟組織中和血管緊張素II（An- giotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）刺激的心肌細(xì)胞中表達(dá)顯著升高；抑制FPPS可明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大，改善SHR心肌肥厚、心肌纖維化。此外，心臟特異性過表達(dá)FPPS的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)心肌肥厚、心力衰竭、纖維化，為FPPS參與心肌重構(gòu)提供更加直接的證據(jù)。本文采用伊班膦酸鈉溶液皮下注射對(duì)糖尿病心肌病大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，探討抑制法尼基焦磷酸合成酶是否可改善糖尿病心肌病大鼠左心室重構(gòu)與心功能障礙，為探索糖尿病心肌病治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡雄性（SD）大鼠30只，清潔級(jí)，體重（120±20）g左右，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2008-0033]。12/12小時(shí)人工晝夜交替，所有SD大鼠均自由覓食和飲水，鼠房溫度18～20℃，濕度40%～60%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品：鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）、伊班膦酸鈉，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；普通飼料（20%粗蛋白、4%粗脂肪、5%粗纖維、其他71%）、高脂飼料（10%豬油、10%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鈉、76.5%普通飼料）由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；10%水合氯醛、檸檬酸、檸檬酸鈉等由浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江醫(yī)院老年病研究所提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：Med-lab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)、動(dòng)物血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定系統(tǒng)購(gòu)自中國(guó)南京美易科技有限公司。安準(zhǔn)血糖儀、血糖試紙購(gòu)自三諾生物傳感股份有限公司。Olympus AU5421全自動(dòng)生化分析儀、RoChe Cobas e610全自動(dòng)免疫發(fā)光儀均由浙江醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。電子天平由浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江醫(yī)院老年病研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：

1.2.1

動(dòng)物分組及動(dòng)物模型的建立：SD大鼠30只，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組10只（control組）、糖尿病組10只（DM組）、糖尿病.伊班膦酸鈉組10只（DM+IB組）。control組大鼠喂以普通飼料，DM、DM +IB組大鼠喂以高脂高糖飼料；4周后行糖耐量及胰島素耐量試驗(yàn)，DM與DM +IB組出現(xiàn)胰島素抵抗者給予一次性腹腔注射ST230mg/kg（以O(shè).lmmol/L、pH4.2的枸櫞酸緩沖液溶解STZ并稀釋至1%濃度）；同時(shí)control組給予同等劑量的枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射。72小時(shí)后尾靜脈取血，測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L，同時(shí)出現(xiàn)多尿、多飲、多食現(xiàn)象的大鼠視為糖尿病動(dòng)物模型建立成功并納入實(shí)驗(yàn)。建模成功后（第5周）DM +IB組SD大鼠連續(xù)16周每天于背部肩胛骨位置皮下注射5微克/千克劑量伊班膦酸鈉溶液（每周稱量體重1次，根據(jù)體重改變藥物劑量），其它兩組SD大鼠在相同位置皮下注射相等劑量的0.9%氯化鈉注射液作為對(duì)照。

1.2.2 血生化及體重監(jiān)測(cè)：各組SD大鼠分別于0周（實(shí)驗(yàn)前）、4周及21周（伊班膦酸鈉干預(yù)16周）禁食不禁水12h過夜后用電子天平稱量大鼠空腹體重。然后尾靜脈抽取血液3～4ml裝于醫(yī)用生化管中，靜置30分鐘后分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定空腹血糖（Fast Bkxd CJlucose，F(xiàn)BG）、總膽固醇（TotalCholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（Lipoprc，tein，LDL-C），全自動(dòng)免疫發(fā)光儀測(cè)定空腹胰島素（Fasting Insulin，F(xiàn)INS），并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（Insulin Sensitivity Index，ISI）.

1.2.3 SD大鼠心臟超聲測(cè)定：實(shí)驗(yàn)?zāi)?，大鼠腹腔注射IO%水合氯醛（400mg/kg）麻醉，待大鼠進(jìn)入睡眠狀態(tài)時(shí)，左側(cè)臥位，使用Philips 7500數(shù)字化超聲心動(dòng)圖儀（探頭頻率10～15MHz），將15HMZ超聲探頭放置于心前區(qū)，二維圖像取胸骨旁左心室長(zhǎng)軸切面，待圖像清晰穩(wěn)定后取得M型曲線圖，測(cè)得左心室舒張末期后壁厚度（LVPWd）、舒張末期室間隔厚度（IVSd）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）；并根據(jù)LVEDd、LVESd計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短縮率（FS）。endprint

1.2.4 大鼠血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定：待心臟超聲測(cè)定完后，仰臥固定大鼠，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉固定近心端，用小型眼科剪剪一V型切口，將PE50導(dǎo)管（內(nèi)徑1mm）順著動(dòng)脈在主動(dòng)脈瓣開放時(shí)插入左心室，固定心導(dǎo)管，經(jīng)壓力換能器連接Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，穩(wěn)定I5～20分鐘左右，記錄血流動(dòng)力學(xué)各種參數(shù)，包括左心室收縮壓（Left VentricularSystolic Pressure，LVSP）、左心室舒張末壓（Left Ventricu-lar En（1-diastolic Pressure，LVEDP）、左心室壓力上升最快速率（Left Ventricular Pressure Maximum Rise Velocity，+dp/dt）及左心室壓力下降最快速率（Left VentricularPressure Maximum Fall Velocity，-dp/dt）等參數(shù)。

1.2.5 大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)測(cè)定：心導(dǎo)管測(cè)定完畢，處死大鼠，將大鼠稱重后取心臟，冰0.9%氯化鈉注射液沖洗，濾紙吸干，剪去血管、心耳及心外膜脂肪纖維組織，沿室間隔分離左心室（包括室間隔），稱重，計(jì)算心臟指數(shù)（HMI）和左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI），HMI：全心質(zhì)量/體質(zhì)量（HW/BW，mg/g），LVMI=左心室質(zhì)量/體質(zhì)量（LVW/BW，mg/g。

1.2.6 心肌組織HE染色與Masson染色：上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速分離部分左心室心肌組織，置入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制作Sum厚的石蠟切片，并行HE與Masson復(fù)合染色。HE染色在光鏡下可以觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化。Masson染色后光鏡下觀察心肌組織，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并采集圖像數(shù)據(jù)；應(yīng)用Image Pro Plus圖像分析軟件對(duì)所采圖像進(jìn)行分析，測(cè)定膠原纖維染色面積與組織切片面積之比，即膠原容積分?jǐn)?shù)（Collagen Vohne Frac-tion，CVF）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SAS9.3（SAS Institute，CaIy，North Carolina）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成。計(jì)量數(shù)據(jù)以（ ±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；應(yīng)用析因方差分析法尼基焦磷酸合成酶抑制劑伊班膦酸鈉對(duì)糖尿病心肌病左室重構(gòu)與心臟功能等相關(guān)指標(biāo)的影響；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況、血糖血脂及全心質(zhì)量指數(shù)、左心室重量指數(shù)變化：采用4周高脂高糖飲食造成大鼠糖脂代謝異常后給與一次性腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ 30mg/kg），4周及21周時(shí)發(fā)現(xiàn)DM及DM+IB組FINS、IRI、血清TC、TG、LDL-C均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。伊班膦酸鈉干預(yù)對(duì)DM大鼠FBG、FINS、ISI等糖代謝指標(biāo)無明顯影響，但能降低TC及LDL-C水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），見表1、表2。DM組成模8只、死亡1只、血糖未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)1只；DM+lB組成模7只，死亡2只、血糖未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)1只。DM組和DM +lB組大鼠精神萎靡，毛色枯黃無光澤，鼠身多處浸滿尿漬，進(jìn)食量、飲水量及尿量較Control組均明顯增多，活動(dòng)減少。DM組HMI、LV-Ml較對(duì)照組高，DM +lB組較DM組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。DM組大鼠心重指數(shù)較control組增高，說明已成功建立DCM模型。

2.2 各組大鼠心臟超聲測(cè)試結(jié)果比較：與對(duì)照組相比，糖尿病組和伊班膦酸鈉治療組IVSd、LVPWd、LVEDd、LVEDs與LVEDs均顯著升高（P<0.01），F(xiàn)和EF均顯著降低（P<0.01）；但伊班膦酸鈉治療組與糖尿病組相比，LVPWd、LVEDd和LVEDs均有顯著的改善（P<0.01），而IVSd、FS和EF有明顯改善（P<0.05），見表3。

2.3 各組大鼠心功能結(jié)果比較：與對(duì)照組比較，糖尿病大鼠LVDP、LVEDP及-dp/dtmax顯著增高（P<0.01），+dp/dtmax顯著降低（P<0.01），LVSP明顯降低（P<0.05）；與對(duì)照組比較，伊班膦酸鈉治療組LVEDP和-dp/dtmax有所升高（P<0.05），+dp/dt-max有所降低（P<0.05）；但伊班膦酸鈉治療組與糖尿病大鼠組相比，LVDP、LVEDP及-dp/dtmax明顯降低（P<0.05），LVSP和+dp/dtmax明顯升高（P<0.05），見表4。

2.4 各組大鼠心肌組織膠原纖維染色比較：第21周末，HE染色顯示，對(duì)照組大鼠心肌纖維間排列整齊、纖細(xì)，結(jié)構(gòu)清楚，普遍心肌細(xì)胞束間隙變窄，間質(zhì)可見少量成纖維細(xì)胞；糖尿病大鼠心肌細(xì)胞肥大、扭曲，排列紊亂，心肌纖維間排列紊亂，分布不勻，結(jié)構(gòu)不清晰；伊班膦酸鈉干預(yù)組大鼠較糖尿病組上述異常改變明顯減輕。Masson染色結(jié)果：對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞間、血管周圍可見少量膠原纖維，糖尿病組大鼠心肌間質(zhì)和血管周圍膠原纖維較對(duì)照組顯著增多，伊班膦酸鈉干預(yù)后纖維化程度減輕，見圖2。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)Masson染色圖片視野并采集圖像數(shù)據(jù)，應(yīng)用Image Pro Plus圖像分析軟件對(duì)所采圖像進(jìn)行分析，測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)（Collagen Volume Fraction，CVF）。結(jié)果顯示，糖尿病組膠原面積為（14.34±1.51）%，顯著高于對(duì)照組的（3.90±0.95）%（P<0.01）。伊班膦酸鈉干預(yù)組為（9.38±1.28）%顯著低于糖尿病組（P<0.05）。

3 討論

心功能不全為DCM最常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為早期以心臟舒張功能不全、晚期則以左心室收縮功能受損或全心功能不全為主，容易發(fā)展成充血性心力衰竭。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期伊班膦酸鈉干預(yù)可在一定程度上可改善糖尿病心肌病大鼠左心室重構(gòu)與心臟功能障礙。

本實(shí)驗(yàn)研究中，采用Masson復(fù)合染色觀察糖尿病大鼠左心室膠原纖維沉積情況，結(jié)果提示糖尿病大鼠左心室膠原纖維較對(duì)照大鼠明顯增多，粗大的膠原纖維分布不均勻，排列極其不規(guī)則，相互連接成網(wǎng)狀或團(tuán)塊狀，緊緊密集地繞于心肌細(xì)胞周圍及小血管周圍。HE染色進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞肥大，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)纖維化明顯。結(jié)合彩色超聲心動(dòng)圖及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，結(jié)果顯示糖尿病大鼠無論是收縮還是舒張功能都明顯受損。上述實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均提示糖尿病大鼠存在明顯的左心室重構(gòu)，膠原纖維的大量沉積增加了心室壁的僵硬度，降低了心室順應(yīng)性，最終發(fā)展成心室舒張及收縮功能不全。endprint

給予5微克/千克劑量伊班膦酸鈉皮下注射治療16周后，Masson復(fù)合染色顯示膠原纖維雖有沉積，但程度較糖尿病組明顯改善；HE心肌細(xì)胞橫斷面染色提示伊班膦酸鈉治療后心肌細(xì)胞局灶性肥大得到了明顯的改善；左心室肥厚指標(biāo)如IVSd、LVPWd參數(shù)也較組大鼠減輕，此外，心肌纖維化指標(biāo)如全心質(zhì)量指數(shù)、左心室重量指數(shù)也較對(duì)照組下降明顯。伊班膦酸鈉抑制左室重構(gòu)的同時(shí)帶來了左心室收縮及舒張功能的改善，如左心室LVEF，LVFS，+dp/dtmax等收縮指標(biāo)較糖尿病組升高，而LVEDP，-dp/dtmax等舒張指標(biāo)則較糖尿病組下降。上述結(jié)果提示抑制法尼基焦磷酸合成酶改善糖尿病心肌病大鼠左心室重構(gòu)與心力衰竭。

糖尿病心肌病變確切的發(fā)病機(jī)制還不清楚，涉及多種影響因素：心肌細(xì)胞代謝紊亂（如葡萄糖、游離脂肪酸代謝紊亂）、微血管病變、心肌自主神經(jīng)病變、胰島素抵抗和氧化應(yīng)激反應(yīng)等均促進(jìn)糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)伊班膦酸鈉干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠FBG、FINS、ISI、TG、HDL等糖脂代謝指標(biāo)無明顯影響，但能降低TC及LDL-C水平（P<0.01），這與國(guó)外許多學(xué)者研究結(jié)果一致。但伊班膦酸鈉是否通過降低TC與LDL-C水平從而改善心肌重構(gòu)與心臟功能需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

伊班膦酸鈉可改善DCM左心室肥厚、心肌間質(zhì)纖維化和左室收縮、舒張功能，但其信號(hào)通路在本研究中目前尚未進(jìn)一步深入研究。諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。同樣研究表明小GrIP蛋白參與調(diào)控心肌細(xì)胞的肥厚，及MAPKs通路的活化。FPPS作為甲羥戊酸途徑關(guān)鍵酶之一，通過調(diào)控RhoA/ROCK/MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮其抗細(xì)胞增殖、分化及肥厚反應(yīng)等生物多效性。已有研究發(fā)現(xiàn)利用含氮雙磷酸鹽（N-BPs）或慢病毒介導(dǎo)的siRNA-FPPS，抑制FPPS，能通過抑制RhoA/ROCK/MAPK家族磷酸化從而明顯改善SHR心肌肥厚、心肌纖維化。故本實(shí)驗(yàn)研究中伊班膦酸鈉可能通過抑制FPPS活性下調(diào)小GrIP蛋白的表達(dá)從而抑制MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終改善DCM大鼠左室重構(gòu)與心力衰竭，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步論證。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示FPPS抑制劑伊班膦酸鈉可減輕DM心肌病變，延緩DCM進(jìn)展，改善了心肌的病理變化，保護(hù)心功能，可能為DCM治療提供了一種新的思路和策略。endprint