盧 虹， 徐愛(ài)遐

（西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 楊凌712100）

油菜屬于十字花科蕓薹屬，是世界四大油料作物（大豆、油菜、花生、向日葵）之一。中國(guó)是重要的油菜生產(chǎn)國(guó)，2013—2014年度中國(guó)的油菜籽產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的20.6%。2012—2013年度中國(guó)油料播種面積為1 402.3萬(wàn)hm2，油菜籽播種面積為753.1萬(wàn)hm2，占油料播種面積的53.7%。2012—2013年度較往年油菜播種面積、總產(chǎn)增加，但是單產(chǎn)降低［1］，雜種優(yōu)勢(shì)的利用是一種有效的提高油菜產(chǎn)量的重要途徑。

隨著油菜雜種優(yōu)勢(shì)的利用，市場(chǎng)上的雜交油菜推廣面積占油菜生產(chǎn)總面積的60%［2］。雜種利用的主要途徑有：細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）、細(xì)胞核雄性不育（GMS）、化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育（CHA）和自交不親和性（SI）等［3］，但目前應(yīng)用于生產(chǎn)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育主要是高溫不育型，在低溫條件下容易產(chǎn)生微粉，造成自交結(jié)實(shí)從而影響雜交種的純度［4］。因此，對(duì)雜交種的純度研究顯得尤為重要。

目前，農(nóng)作物雜交種純度的鑒定方法主要有三大類：形態(tài)學(xué)鑒定、生化標(biāo)記鑒定和DNA水平鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定周期長(zhǎng)，易受環(huán)境影響，相似形態(tài)特征的鑒定困難，鑒定者的經(jīng)驗(yàn)制約設(shè)鑒定的準(zhǔn)確性，而且花費(fèi)高；生化標(biāo)記鑒定不穩(wěn)定受環(huán)境影響較大，具有嚴(yán)格的組織和時(shí)間表達(dá)特異性［5－6］。DNA水平鑒定有DNA分子標(biāo)記技術(shù)和基因組DNA的光譜分析（Fourier transform infrared spectroscopy）［7］，DNA 分子標(biāo) 記技術(shù)可以有效的避免上述問(wèn)題，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要包括RAPD、SRAP、SSR、ISSR、EST－SSR、INDEL、AFLP 等［8－12］。其中，SSR分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于油菜［13］、大豆［14］、向日葵［15］、棉花［16］、水稻［17－8］、玉米［19］等的雜交種純度鑒定。

本試驗(yàn)利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜陜油16雜交種純度進(jìn)行研究，以期找到可以鑒定陜油16雜交種純度的SSR標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘藍(lán)型油菜雜交種陜油16及其雙親9A（♀）和530C（♂）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜中心品種資源課題組提供。陜油16大田制種種子樣本由楊凌金諾公司和楊凌高科公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

80對(duì)引物來(lái)源于白菜型油菜基因組已公布信息，下載網(wǎng)址 http：／／brassicadb.org／brad／geneticMarker.php？chr＝ALL。所有引物均有上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 DNA的提取與檢測(cè)

雜交種陜油16及其親本各取100粒，大田制種種子各取400粒，分別均勻放入鋪有2層吸水紙的培養(yǎng)皿中，早晚各澆水1次，室溫下發(fā)芽5～7d。取幼芽上半部分放入研缽中，隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)材料父本、F1、母本標(biāo)準(zhǔn)樣品10個(gè)單株的幼嫩子葉分別混合磨樣，提取DNA用于標(biāo)記篩選。陜油16大田制種材料分別取188株并編號(hào)，進(jìn)行單株DNA提取，用于純度鑒定?；蚪MDNA提取采用CTAB法進(jìn)行［20］。

1.2.3 雜交種及其親本的SSR分析

1）PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸45s，此后每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃，共計(jì)9個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s，29個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

表1 PCR反應(yīng)體系

2）電泳檢測(cè)。樣品從PCR中取出來(lái)后加入等體積的Loading buffer，放入水浴中變性5min，然后放入冰水混合物中冷卻；然后在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳（U＝2 000VI＝200AP＝85W）45min左右；電泳完成后，用10%醋酸固定20min后，蒸餾水漂洗2遍，每次10min；然后用硝酸銀染色、碳酸鈉顯影，再用10%醋酸固定，經(jīng)漂洗后自然風(fēng)干，拍照保存。

1.3 種子純度的鑒定

1.3.1 SSR分子標(biāo)記鑒定

用80對(duì)SSR引物在構(gòu)建的陜油16及其雙親的基因池中進(jìn)行篩選，用篩選到的具有差異的SSR引物鑒定陜油16大田制種材料的純度。雜交種純度（%）＝具有雙親特征條帶的樣本數(shù)／檢測(cè)的樣本總數(shù)×100%。

1.3.2 田間植株鑒定

陜油16種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜實(shí)驗(yàn)基地，每個(gè)品種設(shè)2個(gè)小區(qū)，進(jìn)行常規(guī)田間管理，不間苗，在盛花期統(tǒng)計(jì)總株數(shù)以及不育株數(shù)。

鑒定方法為：當(dāng)天開(kāi)的花中，如果有花朵的花藥高于柱頭、正常散粉且發(fā)育正常則記為可育株，花朵較小、花藥等于或低于柱頭且雄蕊退化不能散粉的單株記為不育株，其中未開(kāi)花的單株不計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征型引物的篩選

用80對(duì)SSR引物在陜油16雜交種及其親本中進(jìn)行篩選和群體驗(yàn)證后，確定有3對(duì)引物SSR 313、SSR 354、SSR 359在陜油16雜交種及其親本中存在多態(tài)性，擴(kuò)增帶型清晰，容易分辨，且在陜油16及其雙親中表現(xiàn)共顯性，見(jiàn)圖1，引物序列見(jiàn)表2。

2.2 SSR標(biāo)記用于陜油16雜交種種子純度鑒定

試驗(yàn)中共檢測(cè)了188個(gè)陜油16雜交種單株（如圖2～圖4箭頭所示），與P1條帶相同的記為母本（不育系），與P2條帶相同的記為父本（恢復(fù)系），與F1條帶相同的記為雜交種；圖2，圖3，圖4分別是SSR 313、SSR 354、SSR 359用于陜油16大田制種種子純度鑒定圖（部分）。

表2 SSR引物序列

圖1 SSR引物對(duì)陜油16及其親本的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 SSR 313對(duì)陜油16部分單株及其親本的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 SSR 354對(duì)陜油16部分單株及其親本的擴(kuò)增結(jié)果

圖4 SSR 359對(duì)陜油16部分單株及其親本的擴(kuò)增結(jié)果

統(tǒng)計(jì)2品種雜交種種子中不育系（母本）比率、恢復(fù)系（父本）比率和雜交種純度鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果中不育株比率均大于恢復(fù)系比率。

表3 陜油16雜交種種子純度鑒定結(jié)果

2.3 田間植株鑒定

于油菜盛花期（4月1日）在田間對(duì)陜油16鑒定圃材料進(jìn)行全區(qū)逐株觀察鑒定，鑒別育性。田間種植鑒定結(jié)果顯示，陜油16品種的平均純度為85.61%，結(jié)果見(jiàn)表4。

對(duì)陜油16的SSR鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示，田間鑒定的平均純度高于SSR鑒定結(jié)果3.71%。

表4 陜油16的田間鑒定結(jié)果

3 討 論

首先，本研究篩選的SSR引物在陜油16的F1代雜交種擴(kuò)增結(jié)果均具有親本的兩條帶，說(shuō)明SSR標(biāo)記有穩(wěn)定的共顯性，可以用來(lái)鑒定甘藍(lán)型油菜的雜交種純度。

其次，本研究發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)記鑒定結(jié)果中，不育株率較父本株率高，說(shuō)明母本因微粉導(dǎo)致的自交是雜交種種子純度降低的重要原因。因此，在制種過(guò)程中要特別注意母本的育性，可采用化學(xué)殺雄的方法盡量避免由于微粉造成的雜交種純度降低。

此外，本研究中SSR標(biāo)記純度鑒定結(jié)果均低于田間鑒定結(jié)果，與王同華等［21］的研究結(jié)果一致，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因是田間鑒定主要通過(guò)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行判斷，由于材料間親緣關(guān)系較近，很難做出準(zhǔn)確的鑒定，而SSR分子標(biāo)記技術(shù)可以準(zhǔn)確識(shí)別非雜交單株，如由于母本因微粉導(dǎo)致的自交、花粉污染、機(jī)械混雜等原因造成的混雜，因此，SSR標(biāo)記技術(shù)得到的純度鑒定結(jié)果比種植鑒定的結(jié)果更為可靠、準(zhǔn)確。

［1］王漢中，殷艷.我國(guó)油料產(chǎn)業(yè)形勢(shì)分析與發(fā)展對(duì)策建議［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2014，36（4）：414－421.

［2］傅廷棟.油菜的品種改良［J］.作物研究，2007（3）：159－162.

［3］傅廷棟.雜交油菜的育種與應(yīng)用［M］.武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1995：124－129.

［4］蘇英.甘藍(lán)型油菜品種的細(xì)胞質(zhì)育性類型初探［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（6）：181－182，246.

［5］梅眉，陸璐.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗(yàn)中的應(yīng)用［J］.分子植物育種，2005，3（1）：129－134.

［6］劉子記，曹振木，楊衍.應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)作物雜交種純度研究進(jìn)展［J］.種子，2013，32（6）：48－52.

［7］Song S Y，Eun Y J，Myung S A，et al.Fourier transform infrared（FT－IR）spectroscopy of genomic DNA to discriminate F1progenies from their paternal lineage of Chinese cabbage（Brassica rapasubsp.pekinensis）［J］.Molecular Breeding，2013，33（2）：453－464.

［8］Huang C Q，Liu G D.Bai C J，et al.Application of SRAP markers in the identification of Stylosanthes guianensis hybrids［J］.Mol Biol Rep，2014，41（9）：5 923－5 929.

［9］Ye S，Wang Y，Huang D Q，et al.Genetic purity testing of F1hybrid seed with molecular markers in cabbage（Brassica oleracea var.capitata）［J］.Scientia Horticulturae，2013，155：92－96.

［10］Naresh V，Yamini K N，Rajendrakumar P，et al.EST－SSR marker－based assay for the genetic purity assessment of safflower hybrids［J］.Euphytica，2009，170（3）：347－353.

［11］王玲平，戴丹麗，吳曉花，等.AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在浙蒲2號(hào)種子純度快速鑒定中的應(yīng)用［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20（2）：84－87.

［12］葛敏，蔣璐，張曉林，等.利用Insertion／Deletion（InDel）分子標(biāo)記檢測(cè)玉米互交種混雜的原理及應(yīng)用［J］.分子植物育種，2013，32（1）：37－47.

［13］Chen F，Zhang J F，Chen S，et al.A Method for Rapid Identification of Ningza 11［J］.Molecular Biology and Tissue Culture，2014，15（1）：9－12.

［14］Zhang C B，Peng B，Zhang W L，et al.Application of SSR Markers for Purity Testing of Commercial Hybrid Soybean（Glycine max L.）［J］.Journal of Agriculture Science and Technology，2014，16：1 389－1 396.

［15］Pallavi H M，Rame G，Shadashari Y G，et al.Identification of SSR markers for hybridity and seed genetic purity testing in sunflower （Helianthus annuus L.）［J］.Helia，2011，34（54）：59－66.

［16］Dongre A，Vilas P.Identification of Cotton Hybrid through the Combination of PCR Based RAPD，ISSR and Microsatellite Markers［J］.J.Plant Biochemistry ＆ Biotechnology，2005，14：53－55.

［17］Sundaram R M，Naveenkumar B，Biradar S K，et al.Identification of informative SSR markers capable of distinguishing hybrid rice parental lines and their utilization in seed purity assessment［J］.Euphytica，2008，163（2）：215－224.

［18］Hashemi S H，Sayyed A M M，Ghorban A N，et al.Identification of rice hybrids using microsatellite and RAPD makers［J］.African Journal of Biotechnology，2009，8（10）：2 094－2 101.

［19］李曉輝，李新海，李文華，等.SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米雜交種種子純度測(cè)定中的應(yīng)用［J］.作物學(xué)報(bào)，2003，29（1）：63－68.

［20］Doyle J J，Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］.Phytochemical Bulletin，1987，19：11－15.

［21］王同華，陳衛(wèi)紅，李莓，等.基于SSR標(biāo)記技術(shù)的油菜雜交品種灃油958的種子純度鑒定［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014，18：20，25.