孫亞楠，劉曉虹，毛曉韻，金泉秀，蘇芃，金鋒(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

甲狀腺乳頭狀癌組織Bag-1、Bcl-2蛋白表達變化及意義

孫亞楠，劉曉虹，毛曉韻，金泉秀，蘇芃，金鋒
(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

摘要:目的觀察甲狀腺乳頭狀癌組織Bag-1、Bcl-2蛋白的表達變化，并探討其意義。方法采用免疫組化SP法檢測120例份甲狀腺乳頭狀癌及癌旁配對正常甲狀腺組織中Bag-1與Bcl-2蛋白，并分析兩種蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果甲狀腺乳頭狀癌及癌旁配對正常甲狀腺組織中Bag-1表達的陽性率分別為72.5%、9.2%，Bcl-2表達的陽性率分別為81.7%、11.7%，兩者比較，P均＜0.05。不同腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況甲狀腺乳頭狀癌腫瘤組織Bag-1、Bcl-2蛋白表達比較，P均＜0.05。甲狀腺乳頭狀癌組織中Bag-1與Bcl-2蛋白陽性表達呈正相關(guān)( r =0.797，P＜0.01)。結(jié)論甲狀腺乳頭狀癌Bag-1與Bcl-2蛋白高表達，且二者表達密切相關(guān)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

關(guān)鍵詞:甲狀腺腫瘤;甲狀腺乳頭狀癌; Bag-1蛋白; Bag-2蛋白

Expression changes of Bag-1 and Bcl-2 in papillary thyroid carcinoma tissues and the significance

SUN Ya-nan1，LIU Xiao-hong，MAO Xiao-yun，JIN Quan-xiu，SU Peng，JIN Feng
( 1 The First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China)

Abstract:Objective To observe the expression changes of Bag-1 and Bcl-2 in papillary thyroid carcinoma ( PTC) tissues and to investigate the significance.Methods The Bag-1 and Bcl-2 expression was analyzed by immunohistochemistry in 120 cases of PTC tissues and paired adjacent normal thyroid tissues.The relationships between the expression of the two proteins and the clinicopathological parameters of PTC were analyzed.Results The Bag-1 positive expression rates in PTC tissues and paired adjacent normal thyroid tissues were 72.5% and 9.2%，and the Bcl-2 positive expression rates were 81.7% and 11.7%，respectively ( all P＜0.05).Furthermore，both Bag-1 and Bcl-2 protein positive expression was significantly associated with lymph node metastasis and tumor size in PTC ( all P＜0.05).Bag-1 positive expression was positively correlated with the Bcl-2 positive expression ( r = 0.797，P＜0.01).Conclusion In PTC tissues，the Bag-1 and Bcl-2 expression is high，and their expression is closely related，which plays an important role in the development of PTC.

Key words:thyroid neoplasms; papillary thyroid carcinoma; Bag-1;B-cell lymphoma 2

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1］，甲狀腺乳頭狀癌是其中最常見的一種，約占甲狀腺癌的90%。Bag-1基因于1995年首先被報道［2］，其分泌蛋白是一種多功能結(jié)合蛋白，可與酪氨酸激酶生長因子受體、肝細胞生長因子、血小板衍生生長因子相聯(lián)結(jié)，加強其功能而抑制凋亡，還可以與Hsp70、孕激素受體、糖皮質(zhì)激素受體等多種信號因子相結(jié)合，調(diào)節(jié)其功能［3］。Bcl-2是從B淋巴細胞中首先分離出來的一種原癌基因［4］，過度表達或失調(diào)均可阻斷細胞凋亡，延長細胞壽命，從而導致細胞過度增殖而形成腫瘤。Bag-1與Bcl-2形成復(fù)合物后抗細胞凋亡能力

增強，還可上調(diào)Bcl-2的抗凋亡能力［2，5］。然而二者在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本實驗觀察了甲狀腺乳頭狀癌組織Bag-1、Bcl-2蛋白的表達變化，并探討其意義。

1　材料與方法

1.1標本來源收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科2007年1月～2012年10月無家族史新鮮甲狀腺乳頭狀癌癌標本及癌旁配對正常甲狀腺組織120例份。標本來源的患者年齡27～81歲、中位年齡43.6歲，所有患者均為初次手術(shù)，其手術(shù)切除標本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、固定后行HE染色，經(jīng)2位病理醫(yī)生按世界衛(wèi)生組織( WHO)《甲狀腺和甲狀旁腺腫瘤組織學分類》( 2006新版)標準讀片確認其病理類型。

1.2 Bag-1、Bcl-2蛋白檢測方法及結(jié)果判定石蠟切片脫蠟、水化后高壓抗原修復(fù)。采用SP法行Bag-1(鼠抗人Bag-1多克隆抗體sc-56003，1∶150，Santa Cruz，美國)及Bcl-2(鼠抗人Bcl-2多克隆抗體sc-509，1∶200，Santa Cruz，美國)的免疫組化染色(即用型免疫組織化學超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒KIT-9701，福建邁新)，DAB顯色( DAB-1031，福建邁新)，蘇木素復(fù)染。采用雙盲評分法對免疫組化結(jié)果進行判定，Bag-1蛋白陽性反應(yīng)顆粒定位于胞核，Bcl-2蛋白陽性反應(yīng)顆粒定位于胞質(zhì)，在排除非特異性染色的前提下顯微鏡下凡胞核/胞質(zhì)出現(xiàn)清晰的棕黃色染色的細胞即為陽性細胞，在200×視野下隨機選取5個視野(每個視野觀察不少于200個細胞)，按陽性細胞所占的百分比及著色強度進行結(jié)果判定。按著色強度評分:無著色計為0分;淺黃色計為1分;黃色計為2分;棕黃色計為3分。按陽性細胞數(shù)占同類細胞數(shù)的百分比評分:陰性計為0分，陽性細胞百分比≤10%計為1分，11%～50%計為2分，51%～80%計為3分，＞80%計為4分。取兩項評分的乘積作為總積分，≤1為陰性，＞1為陽性。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較用χ2檢驗，兩變量間的相關(guān)性檢驗采用直線相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

甲狀腺乳頭狀癌及癌旁配對正常甲狀腺組織中Bag-1表達的陽性率分別為72.5% ( 87/120)、9.2% ( 11/120)，兩者比較，P＜0.05。甲狀腺乳頭狀癌及癌旁配對正常甲狀腺組織中Bcl-2表達的陽性率分別為81.7%( 98/120)、11.7%( 14/120)，兩者比較，P＜0.05。Bag-1和Bcl-2蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。不同腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況甲狀腺乳頭狀癌腫瘤組織Bag-1、Bcl-2蛋白表達比較，P均＜0.05。87例Bag-1陽性表達的甲狀腺癌組織中有77例Bcl-2亦為陽性表達。甲狀腺乳頭狀癌組織中Bag-1與Bcl-2蛋白陽性表達呈正相關(guān)( r =0.797，P＜0.01)。

表1　 Bag-1和Bcl-2蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

3　討論

腫瘤的發(fā)生與細胞凋亡和增殖失衡有關(guān)［6］。腫瘤細胞的凋亡受多種基因表達方式改變的影響，Bag-1和Bcl-2基因是參與細胞凋亡調(diào)控的主要基因。Bag-1基因位于9p12號染色體，是一種新的非Bcl-2家族的Bcl-2結(jié)合蛋白，主要功能為抑制細胞凋亡。Bag-1蛋白具有4種亞型［7］，即p50 ( Bag-1L)，p46( Bag-1M)，p33( Bag-1S)和p29，是由共同的mRNA通過選擇不同的起始部位進行翻譯產(chǎn)生的。Bag-1L主要分布在細胞核，Bag-1M及Bag-1S則主要分布在細胞質(zhì)，p29主要分布在細胞膜［8］，但是他們都擁有共同位于羧基末端的Bag功能區(qū)。研究［9］表明，Bag功能區(qū)可與Hsp70結(jié)合而進一步發(fā)揮作用。Bag-1在正常組織中幾乎不表達，在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、口腔鱗癌等惡性腫瘤中都有陽性表達［10～14］。然而文獻中關(guān)于Bag-1與腫瘤預(yù)后關(guān)系的結(jié)論并不一致，有的提出Bag-1陽性表達與腫瘤的發(fā)生及惡性程度有關(guān)，惡性程度越高，Bag-1蛋白陽性表達率也越高，有的則表示Bag-1是預(yù)后良好的指標。Ni等［15］對65例肝細胞癌組織研究發(fā)現(xiàn)，Bag-1在肝癌細胞核中高表達，進一步統(tǒng)計分析表明Bag-1核表達與肝癌組織學分級相關(guān)，提示較差預(yù)后，同時該實驗用小RNA干擾技術(shù)敲掉Bag-1高表達的HepG2細胞系中的Bag-1基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞遷徙及增殖能力明顯下調(diào)。Liu

等［16］發(fā)現(xiàn)，對比正常的乳腺癌MCF-7細胞系，三苯氧胺耐藥的MCF-7細胞系( TAMR/MCF-7)中Bag-1高表達，下調(diào)TAMR/MCF-7細胞系中Bag-1基因表達，可以顯著增強該細胞系對三苯氧胺治療的敏感性。相反的，Van der Zee等［12］對217例根治性切除的胰頭或壺腹周圍癌石蠟標本進行免疫組化染色，結(jié)果顯示80%癌組織存在Bag-1核表達，且預(yù)后分析顯示，Bag-1核表達是胰頭癌預(yù)后良好的指標。本實驗發(fā)現(xiàn)，相比癌旁正常組織，Bag-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達，陽性表達率為72.5%，且腫瘤直徑越大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越快，其表達越高，提示Bag-1的高表達可能預(yù)示著甲狀腺癌的高侵襲性和不良預(yù)后。

Bcl-2基因通過廣泛抑制各種刺激因素誘導的細胞凋亡，延長細胞活力而發(fā)揮生物學作用。Bcl-2過度表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可導致DNA受損的細胞持續(xù)生存，突變產(chǎn)物聚集，從而導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Ito等［17］研究結(jié)果顯示，Bag-1 與Bcl-2在甲狀腺腫瘤中的表達具有相關(guān)性，二者可能共同參與腫瘤間變性轉(zhuǎn)化過程。劉主才等［18］研究了48例甲狀腺癌、11例甲狀腺腺瘤中Bag-1及Bcl-2蛋白的表達情況，并進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示Bag-1、Bcl-2蛋白在甲狀腺癌中的表達率分別為66.7%及75.0%，均高于甲狀腺腺瘤，且甲狀腺癌中兩基因的表達呈正相關(guān)，Bag-1表達水平與甲狀腺癌組織學分型、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性。陳建國等［19］構(gòu)建反義雙靶區(qū)重組載體pVITRO2-AsBAG-1-Bcl-2，發(fā)現(xiàn)其能抑制胃癌細胞系SGC-7901的細胞增殖并引起細胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，相比癌旁正常組織，Bcl-2在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達，陽性表達率為81.7%，且腫瘤直徑越大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越快，其表達越高。本研究相關(guān)性分析顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中Bag-1與Bcl-2蛋白陽性表達呈正相關(guān)，提示二者可能在調(diào)節(jié)甲狀腺濾泡上皮的凋亡中扮演重要角色，能使更多的上皮細胞具有逃避凋亡的能力，甲狀腺癌的發(fā)生可能與Bag-1及Bcl-2過量表達有關(guān)。

可見，甲狀腺乳頭狀癌Bag-1與Bcl-2蛋白表達增多，且二者表達密切相關(guān)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

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收稿日期:( 2015-05-24)

通信作者簡介:金鋒( 1963-)，男，教授，博士生導師，主要研究方向為乳腺癌發(fā)生發(fā)展分子機制研究及乳腺疾病外科手術(shù)治療臨床工作。E-mail: jinfeng66cn@ hotmail.com

作者簡介:第一孫亞楠( 1982-)，女，主治醫(yī)師，講師，主要研究方向為腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制研究及普通外科手術(shù)治療臨床工作。E-mail: night408@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目( 81201886)。

文章編號:1002-266X( 2015) 31-0011-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R736.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.004