盧海龍，楊榮禮，李雷(徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，江蘇徐州221006)

體外高糖環(huán)境對H9C2心肌細胞增殖的影響及其機制探討

盧海龍，楊榮禮，李雷
(徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，江蘇徐州221006)

摘要:目的觀察體外高糖環(huán)境對H9C2心肌細胞增殖的影響，并探討其作用機制。方法將體外培養(yǎng)鼠胚心肌細胞H9C2隨機分為四組，1組培養(yǎng)液中加入終濃度為5.5 mmol/L的D-葡萄糖，2組加入終濃度為27.5 mmol/L的甘露醇和5.5 mmol/L的D-葡萄糖，3組加入終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖，4組加入終濃度為2 μmol/L的經(jīng)典瞬時受體蛋白( TRPC)阻滯劑SKF96365和終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖。分別在培養(yǎng)24、48、72 h時，采用CCK8法測定細胞增殖率，實時定量PCR法測定經(jīng)典瞬時受體蛋白6( TRPC6)、活化T細胞核因子3( NFAT3) mRNA; 72 h時采用Western blotting法檢測TRPC6及NFAT3蛋白。結(jié)果培養(yǎng)72 h時1、2、3、4組細胞增殖率分別為105.88%±10.01%、98.67%±8.97%、28.55%±6.32%、49.18%±7.14%，3組較1、2組降低( P均＜0.05)，4組較3組增高( P＜0.05) ; 3組TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對表達量較1、2組增加( P均＜0.05)，4組較3組下降( P均＜0.05)。結(jié)論高糖抑制心肌細胞增殖;促進心肌細胞TRPC6表達，導致TRPC通道開放，啟動鈣調(diào)神經(jīng)素( CaN)/活化T細胞核因子( NFAT)通路，可能是其作用機制。

關(guān)鍵詞:糖尿病心肌病;高糖;鼠胚心肌細胞株H9C2;經(jīng)典瞬時受體蛋白6;活化T細胞核因子3

糖尿病心肌病( DCM)早期表現(xiàn)為舒張性左心功能不全，晚期容易并發(fā)惡性心律失常、心力衰竭、甚至猝死［1，2］。迄今為止，DCM發(fā)病機制仍不完全明確，治療未有實質(zhì)性突破［3］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞內(nèi)鈣超載與DCM的發(fā)生有關(guān)［4］。高血糖是糖尿病患者的主要特征之一，能夠直接損傷心肌細胞，引起心肌病變［5］。但是，高血糖對心肌細胞內(nèi)鈣超載是否有促進作用及其可能機制，文獻報道較少。2012年9月～2013年7月，本研究以體外培養(yǎng)的鼠胚心肌細胞H9C2為研究對象，觀察體外高糖環(huán)境對細胞形態(tài)及增殖的影響，并探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料鼠胚心肌細胞H9C2購自中國科學院上海生命科學研究院。DMEM培養(yǎng)基、D-葡萄糖、胎牛血清( FBS) (美國Gibco公司)，細胞計數(shù)盒CCK-8(日本Dojindo Lab)，細胞總RNA提取試劑盒、核蛋白提取試劑盒、經(jīng)典瞬時受體蛋白6( TRPC6)和GAPDH引物、DNA marker(上海生物工程有限公司)，實時定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，兔抗大鼠TRPC6單克隆抗體、兔抗大鼠活化T細胞核因子3 ( NFAT3)單克隆抗體、經(jīng)典瞬時受體通道蛋白( TRPC)通道阻滯劑SKF96365(以色列Alomone Labs公司)。

1.2細胞培養(yǎng)及分組處理H9C2細胞在含10% FBS的低糖( 5 mmol/L) DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞生長85%左右培養(yǎng)面積后，0.25%胰酶消化，1∶2傳代，8～9代細胞用于實驗。待細胞成對數(shù)生長后，調(diào)整細胞數(shù)為1×105/L，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h;待細胞成融合狀態(tài)換用無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞呈靜止狀態(tài)，隨機分為四組。1組:培養(yǎng)液中加入終濃度為5.5 mmol/L 的D-葡萄糖; 2組:培養(yǎng)液中加入終濃度為27.5 mmol/L的甘露醇和終濃度為5.5 mmol/L的D-葡萄糖; 3組:培養(yǎng)液中加入終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖; 4組:培養(yǎng)液中加入終濃度為2 μmol/L的SKF96365和終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖。

1.3細胞存活率檢測將各組細胞接種于96孔培養(yǎng)板，分別在培養(yǎng)24、48、72 h時每孔加入CCK-8 10 μL和DMEM 90 μL，37℃、5% CO2條件下孵育1 h，采用酶標儀(λ= 450 nm)記錄各孔光密度( OD)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率( %) = (處理組OD450－空白孔OD450)/(對照組OD450－空白孔

OD450)×100%，每組設(shè)3個復孔，實驗重復3次。空白孔為未加細胞懸液的DMEM培養(yǎng)液，1組即對照組。

1.4 TRPC6、NFAT3 mRNA檢測采用實時定量PCR方法。各組細胞分別在處理24、48、72 h提取細胞總RNA，測定RNA濃度。TRPC6引物序列:上游: 5'-GTCGGTGGTCATCAACTACAATC-3'，下游: 5'-CCACATCCGCATCATCCTCAATT-3'; NFAT3引物序列:上游: 5'-ACAGAAGAGGGGGCGTCTC-3'，下游: 5'-ACCAATAGGGGCAGCACCATA-3'; GAPDH引物序列:上游: 5'-ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA-3'，下游: 5'-TGGGGGCATCGGCAGAAGG-3'。PCR反應條件: 95℃變性5 min、95℃30 s、58℃30 s、70℃30 s，40個循環(huán)。實驗重復3次。以GAPDH為內(nèi)參照，2－ΔΔCt法計算各組TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量。

1.5 TRPC6、NFAT3蛋白檢測各組細胞在培養(yǎng)72 h時(根據(jù)前期實驗結(jié)果確定時間點)采用0.25%胰酶常規(guī)消化并收集，采用Western blotting法檢測TRPC6( 1∶500)、NFAT3( 1∶2 000)蛋白。具體步驟參照試劑盒說明書。實驗重復3次，以GAPDH作為內(nèi)參照。采用Quantity-One軟件分析各組TRPC6、NFAT3蛋白的相對表達量。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料采用珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組細胞增殖率比較在培養(yǎng)72 h時，3組細胞增殖率較1、2組降低( P均＜0.05)，4組較3組增高( P＜0.05) ; 3組72 h時細胞增殖率較48 h時降低( P＜0.05) ; 1、2組細胞增殖率在各時間點均無明顯差異( P均＞0.05) ;見表1。

表1　四組不同時間點細胞增殖率比較( %，±s)

表1　四組不同時間點細胞增殖率比較( %，±s)

注:與同時間點1、2組比較，*P均＜0.05;與同時間點3組比較，△P＜0.05;與同組48 h比較，#P＜0.05。

組別　細胞增殖率24 h　48 h　72 h 1組25.72±1.89　 65.77±6.87　 105.88±10.01 2組　22.55±2.02　 61.92±5.99　 98.67±8.97 3組　16.78±1.36　 43.22±4.59　 28.55±6.32* #4組　18.79±2.65　 55.43±6.01　 49.18±7.14△

2.2各組TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量比較

在培養(yǎng)72 h時，3組TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量較1、2組增加( P均＜0.05)，4組較3組下降( P均＜0.05) ; 3組各時間點比較，P均＜0.05;見表2。

表2　四組不同時間點TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量比較(±s)

表2　四組不同時間點TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量比較(±s)

注:與同時間點1、2組比較，*P均＜0.05;與同時間點3組比較，△P＜0.05;與同組各時間點比較，#P＜0.05。

組別TRPC6 mRNA 24 h　48 h　72 h NFAT3 mRNA 24 h　48 h　72 h 1組　1.03±0.13　0.96±0.09　1.02±0.11　0.97±0.17　0.99±0.13　1.06±0.19 2組　1.07±0.08　1.12±0.15　1.09±0.26　1.14±0.14　1.11±0.11　1.13±0.18 3組　7.23±0.52　11.39±1.17　16.15±1.49* #　5.23±1.43　9.88±1.96　14.44±2.09* #4組　4.64±0.35　6.79±0.44　10.13±0.69#　2.94±0.24　5.32±0.94　8.97±1.73△

2.3各組TRPC6、NFAT3蛋白相對表達量比較在培養(yǎng)72 h時，1、2、3、4組TRPC6蛋白相對表達量分別為0.302±0.017、0.351±0.023、1.874± 0.124、1.214±0.097; NFAT3蛋白相對表達量分別為0.247±0.026、0.298±0.034、1.199±0.104、0.656±0.038; 3、4組均高于1、2組( P均＜0.05)，4組均低于3組( P均＜0.05)。

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)高血糖狀態(tài)會造成心肌細胞胞質(zhì)內(nèi)、線粒體內(nèi)Ca2 +濃度明顯升高，導致心肌細胞舒縮功能障礙及凋亡增加［5，6］。在病理狀態(tài)下，胞外鈣的內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫的釋放則造成細胞質(zhì)內(nèi)鈣超載［7］。細胞外鈣內(nèi)流主要通過電壓門控鈣信道( VOC)、受體門控鈣通道( ROC)和鈣庫操縱性鈣通道( SOC)，其中VOC和ROC主要介導胞外鈣在短時間內(nèi)大量內(nèi)流，SOC則介導小量持續(xù)鈣內(nèi)流。但是，組成SOC及ROC的具體分子實體仍不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，TRPC的同源異構(gòu)體是構(gòu)成細胞膜上SOC和ROC的分子實體，TRPC通道的啟動開放可引起心肌細胞內(nèi)Ca2 +濃度變化，通過鈣調(diào)神經(jīng)素( CaN)/NFAT信號通路在細胞內(nèi)Ca2 +增加誘導的心肌重構(gòu)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，進而觸發(fā)心肌肥大相關(guān)信號轉(zhuǎn)導，引起心肌重構(gòu)和病理性肥厚［8］。Onohara等［9］發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ( AngⅡ)誘導的新生大鼠心肌細胞肥大模型TRPC3、TRPC6 mRNA表達均顯著上調(diào);而敲除TRPC3 或TRPC6中的任何一個，都會明顯抑制心肌細胞肥大效應; PLC介導的1，2-二酰甘油( DAG)的生成增多對上述過程有直接啟動作用。TRPC3與TPRC6均可直接受DAG的啟動開放，TRPC3與TRPC6通道之間有協(xié)同關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6表達程度與心肌細胞

肥大密切相關(guān)，并且證實這種促進心肌細胞肥大的效應是由TRPC介導的Ca2 +-NFAT信號通路完成［7］。在CaN被持續(xù)啟動后，小鼠心肌細胞膜TRPC6表達量明顯增加;在人類心力衰竭的心肌細胞中，TRPC6亦出現(xiàn)類似過表達。Nishida等［10］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素-1( ET-1)、AngⅡ刺激體外大鼠心肌細胞和心肌成纖維細胞，可以顯著提高TRPC6的表達水平;血小板凝結(jié)抑制劑Forskolin可以顯著下調(diào)TRPC6表達; ET-1的這種作用是由Gα12/13( G-12家族蛋白的亞單位)所介導的，并且這種作用通過NFAT的持續(xù)激活持續(xù)啟動。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達TRTRPC6的轉(zhuǎn)基因小鼠NFAT的轉(zhuǎn)錄活性增強，并參與Ca2 +-CaN/NFAT信號通路的正回饋機制，通過抑制5型磷酸二酯酶途徑抑制TRPC6表達活性增加造成的病理性心肌肥大［11］。高糖通過增加人類足突細胞黏連蛋白聚糖-4( SDC-4)和活性氧簇( ROS)的表達調(diào)節(jié)TRPC6的表達［12］。沒有基礎(chǔ)心臟病的Klotho基因缺陷小鼠會出現(xiàn)應激狀態(tài)下的心肌細胞肥大和心室重構(gòu);在健康成年小鼠的心肌細胞中，Klotho通過下調(diào)TRPC6而發(fā)揮心臟保護作用［13］。如果抑制Klotho基因缺陷小鼠TRPC6蛋白的表達，則可以阻止壓力誘導的心肌細胞重構(gòu)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6高表達的小鼠會自發(fā)出現(xiàn)心肌重構(gòu);而Klotho過表達則可以明顯抑制TRPC6導致的心肌重構(gòu)，延長小鼠生存期。Kinoshita等［14］證明，TPRC6蛋白是心鈉肽/腦鈉肽-鳥苷酸環(huán)化酶A ( ANP/BNP-GC-A)信號通路介導的心肌肥大作用的關(guān)鍵靶點。上述研究均證明，TRPC6在心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的橋梁作用。

高糖可使心肌細胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶、Ca2 +-Mg2 +活性減低，使心肌細胞對鈣的攝取和輸送能力下降，導致心肌收縮功能受損。但高糖是否會通過上調(diào)TRPC蛋白的表達，導致胞內(nèi)鈣超載，從而啟動CaN/NFAT信號通路，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究予以證實。

H9C2細胞源于胚胎期大鼠心臟，具有心肌細胞的很多特性; 33 mmol/L葡萄糖作為研究心肌細胞高糖損傷的條件，已經(jīng)被廣泛證實并應用［15］。本研究將H9C2心肌細胞在33 mmol/L葡萄糖條件下培養(yǎng)，細胞出現(xiàn)肥大、變性、壞死，增殖率降低，說明高糖造成細胞損傷。在培養(yǎng)72 h時，3組TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對表達量較1、2組增高;加用TRPC通道阻滯劑skf96365后，心肌細胞增殖率有所增加，TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對表達量下調(diào)。上述結(jié)果提示，在高糖條件下TRPC6可能通過CaN/NFAT3通路造成心肌細胞損傷。

綜上所述，高糖抑制心肌細胞增殖，造成心肌細胞損傷;促進心肌細胞TRPC6表達，導致TRPC通道開放，引起心肌細胞內(nèi)鈣超載，啟動CaN/NFAT3通路，可能是其作用機制。

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收稿日期:( 2014-12-30)

通信作者:楊榮禮，E-mail: yrl6502@ sina.com

基金項目:徐州市科技計劃項目( KC14SH110)。

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0024-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R541

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.008