林靜，李秀紅，梁磊，王毅，陳海潮，楊征，酉鵬華(陜西省人民醫(yī)院，西安710068)

胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素對效應(yīng)T細(xì)胞分化功能的影響

林靜，李秀紅，梁磊，王毅，陳海潮，楊征，酉鵬華
(陜西省人民醫(yī)院，西安710068)

摘要:目的探討體外氧化型低密度脂蛋白( ox-LDL)誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素( TSLP)對效應(yīng)T細(xì)胞分化功能的影響。方法分離并培養(yǎng)人血管平滑肌細(xì)胞、人樹突狀細(xì)胞( DC)、初始T細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，每組設(shè)5個(gè)樣本。對照組、實(shí)驗(yàn)組人血管平滑肌細(xì)胞分別經(jīng)PBS、ox-LDL處理后，取其上清液與DC、初始T細(xì)胞共培養(yǎng); TSLP中和抗體組、中和抗體對照組在實(shí)驗(yàn)組的基礎(chǔ)上分別加入TSLP中和抗體、TSLP非特異性中和抗體與DC、初始T細(xì)胞共培養(yǎng)。采用ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TSLP及Th17細(xì)胞因子IL-17、IL-22、TNF-α水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞構(gòu)成比。結(jié)果與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)上清液TSLP、IL-17、IL-22、TNF-α水平及Th17細(xì)胞構(gòu)成比升高( P均＜0.01)。與實(shí)驗(yàn)組、中和抗體對照組比較，TSLP中和抗體組TSLP、IL-17、IL-22、TNF-α水平及Th17細(xì)胞構(gòu)成比降低( P均＜0.01)。結(jié)論Ox-LDL體外誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的TSLP可促進(jìn)T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。

關(guān)鍵詞:胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生產(chǎn)素;樹突狀細(xì)胞; T細(xì)胞; Th17細(xì)胞;動(dòng)脈粥樣硬化

Influence of thymic stromal lymphopoietin on differentiation of effector T cells

LIN Jing，LI Xiu-hong，LIANG Lei，WANG Yi，CHEN Hai-chao，YANG Zheng，YOU Peng-hua
( Shaanxi Provincial People＇s Hospital，Xi＇an 710068，China)

Abstract:Objective To investigate the influence of thymic stromal lymphopoietin ( TSLP) produced by oxidized-low density lipoprotein ( ox-LDL) -induced human vascular smooth muscle cells in vitro on differentiation of effector T cells.Methods Human vascular smooth muscle cells，human dendritic cells ( DCs) andT cells were isolated and cultured.Then we divided them into 4 groups，and 5 samples in each group.The control group and the experimental group were separately simulated with PBS and ox-LDL.The supernatant was incubated with DCs andT cells.TSLP neutralizing antibody group and neutralizing antibody control group were added with TSLP neutralizing antibody，TSLP non-specific neutralizing antibody，then were co-cultured with DC andT cells.The levels of TSLP and Th17cytokines including IL-17，IL-22 and TNF-α were detected by ELISA，and the flow cytometry was used to detect the proportion of Th17 cells.Results Compared with the control group，the levels of TSLP，IL-17，IL-22，TNF-α and the proportion of Th17 cells were increased in the experimental group ( all P＜0.01).Compared with the neutralizing antibody control group，the levels of TSLP，IL-17，IL-22，TNF-α and the proportion of Th17 cells were decreased in the TSLP neutralizing antibody group ( all P＜0.01).Conclusion TSLP produced by ox-LDL-induced human vascular smooth muscle cells in vitro could promoteT cells differentiating into Th17 cells.

Key words:thymic stromal lymphopoietin; dendritic cells; T cells; Th17cells; atherosclerosis

TSLP受體結(jié)合，在效應(yīng)性T細(xì)胞的分化中起重要作用。但其具體作用機(jī)制尚不明確。2013年2月～2014年12月，我們對氧化型低密度脂蛋白( ox-LDL)誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的TSLP在效應(yīng)性T細(xì)胞分化中的作用進(jìn)行了探討。

1　材料與方法

1.1材料淋巴細(xì)胞分離液購自上海試劑二廠。重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子( GM-CSF)、重組人IL-4、重組人TNF-α、人TSLP、IL-17、IL-22及TNF-α ELISA試劑盒購自eBiosience公司。FITC-抗人CD11c抗體、PE-抗人CD4抗體、FITC-抗人IL-17抗體、IgG同型對照抗體、TSLP中和抗體、對照中和抗體、抗人CD3單克隆抗體、抗人CD28單克隆抗體購自Santa Cruz。T細(xì)胞分選試劑盒購自Miltenyi Biotec公司。

1.2人血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)將人血管平滑肌細(xì)胞株(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心)復(fù)蘇后，于37℃、飽和空氣濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);待細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶+0.01%EDTA消化傳代。以1.0×105/mL接種細(xì)胞至直徑25 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及處理①對照組: PBS與人血管平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，去除細(xì)胞，取其上清液與DC共培養(yǎng)24 h，與初始T細(xì)胞共培養(yǎng)5 d。②實(shí)驗(yàn)組: ox-LDL( 50 μg/mL)與人血管平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，去除細(xì)胞，取其上清液與DC共培養(yǎng)24 h。去除上清液，PBS沖洗3次，與初始T細(xì)胞共培養(yǎng)5 d。③TSLP中和抗體組: ox-LDL( 50 μg/mL)與人血管平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，去除細(xì)胞，取其上清液與DC共培養(yǎng)24 h。去除上清液，PBS沖洗3次，在加入TSLP中和抗體( 1 ng/mL)的培養(yǎng)基中與初始T細(xì)胞共培養(yǎng)5 d。④中和抗體對照組: ox-LDL ( 50 μg/mL)與人血管平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，去除細(xì)胞，取其上清液與DC共培養(yǎng)24 h。去除上清液，PBS沖洗3次，在加入TSLP非特異性中和抗體的培養(yǎng)基中與初始T細(xì)胞共培養(yǎng)5 d。每組設(shè)5個(gè)樣本，5 d后，各組共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入抗人CD3抗體( 5 μg/mL)及抗人CD28抗體( 5 μg/mL)孵育24 h。

1.5培養(yǎng)上清液中TSLP、Th17細(xì)胞因子( IL-17、IL-22及TNF-α)水平檢測采用ELISA法。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)上清液，按照試劑盒的操作步驟檢測培養(yǎng)上清液中TSLP、IL-17、IL-22及TNF-α。實(shí)驗(yàn)設(shè)雙復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1四組人平滑肌細(xì)胞TSLP水平比較對照組、實(shí)驗(yàn)組、TSLP中和抗體組、中和抗體對照組TSLP水平分別為( 1.83±0.25)、( 28.83±6.54)、( 3.87± 1.02)、( 24.55±2.95) pg/mL。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組上清液TSLP水平升高( P＜0.01) ;與實(shí)驗(yàn)組比較，TSLP中和抗體組TSLP水平降低( P＜0.01) ;與中和抗體對照組比較，TSLP中和抗體組TSLP水平降低( P＜0.01)。

2.2四組培養(yǎng)上清液IL-17、IL-22、TNF-α水平比較見表1。

表1　四組培養(yǎng)上清液IL-17、IL-22、TNF-α水平比較( pg/mL，珔x±s)

2.3四組Th17細(xì)胞構(gòu)成比比較對照組、實(shí)驗(yàn)組、TSLP中和抗體組、中和抗體對照組Th17細(xì)胞構(gòu)成比分別為( 0.87±0.22) %、( 9.88±2.16) %、( 3.42 ±1.15) %、( 9.25±1.83) %。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組Th17細(xì)胞構(gòu)成比明顯升高( P＜0.01) ;與實(shí)驗(yàn)組比較，TSLP中和抗體組Th17細(xì)胞構(gòu)成比下降( P＜0.01) ;與中和抗體對照組比較，TSLP中和抗體組Th17細(xì)胞構(gòu)成比明顯降低( P＜0.01)。

3　討論

Th17是近年來發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，其分泌的細(xì)胞因子主要有IL-17、IL-6、TNF-α及IL-22［4］。研究顯示，Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在AS患者斑塊局部及循環(huán)血中大量表達(dá)［5］。AS小鼠伴隨著Th17炎癥反應(yīng)的激活，而敲除IL-17基因可明顯抑制小鼠AS斑塊形成［6，7］。Th17炎癥反應(yīng)對AS發(fā)生有促進(jìn)作用，而并非是AS炎癥反應(yīng)的結(jié)果或其“伴隨效應(yīng)”。

研究表明，微生物、Toll樣受體( TLR)配體以及某些細(xì)胞因子如IL-1β均可通過NF-κB途徑誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)型TSLP［8］。不同細(xì)胞類型產(chǎn)生的誘導(dǎo)型TSLP所需的刺激原不同［9］。在人氣管上皮細(xì)胞，單獨(dú)的TNF-α 或IL-1β刺激可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)型TSLP［10］;而在小氣道上皮細(xì)胞中，只有TNF-α及IL-1β聯(lián)合才可導(dǎo)致誘導(dǎo)型TSLP的產(chǎn)生［11］。因此，不同細(xì)胞類型能否誘導(dǎo)產(chǎn)生誘導(dǎo)型TSLP，由細(xì)胞所處局部微環(huán)境決定。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL刺激人平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生TSLP，表明人血管平滑肌細(xì)胞所處的ox-LDL微環(huán)境是產(chǎn)生誘導(dǎo)型TSLP的決定性因素。TSLP一直被認(rèn)為是Th2炎癥反應(yīng)的“總開關(guān)”，在特異性皮炎、過敏性哮喘等以Th2炎癥反應(yīng)為主的自身免疫性疾病中起主要作用。然而近期研究表明，TSLP也可誘導(dǎo)向Th17細(xì)胞亞群分化。Tanaka等［12］研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)刺激可誘導(dǎo)DC導(dǎo)致效應(yīng)性T細(xì)胞向T2分化，但是TSLP與TLR配體聯(lián)合共同刺激誘導(dǎo)DC導(dǎo)致效應(yīng)性T細(xì)胞向Th17分化。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL誘導(dǎo)產(chǎn)生的誘導(dǎo)型TSLP能夠激活DC，導(dǎo)致Th17細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞因子表達(dá)增加，其可能機(jī)制為ox-LDL可作為配體與TLR結(jié)合，與TSLP聯(lián)合共同刺激促使初始T細(xì)胞向Th17分化。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組上清液TSLP水平升高，表明ox-LDL可誘導(dǎo)人平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生TSLP;抗體中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TSLP中和抗體可顯著降低培養(yǎng)上清液TSLP、IL-17、IL-22水平及Th17細(xì)胞構(gòu)成比，從而阻止DC誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化，進(jìn)一步表明TSLP在DC誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞亞群分化機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，ox-LDL誘導(dǎo)人平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的TSLP可作用于DC，導(dǎo)致效應(yīng)性T細(xì)胞向Th17分化。結(jié)合我們前期研究發(fā)現(xiàn)的AS斑塊中TSLP表達(dá)升高及Th17在AS中的重要作用，認(rèn)為TSLP在AS中的重要作用之一可能為促使T細(xì)胞分化，具體作用及分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

［1］Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340( 2) :115-126.

［2］Stemme S，Holm J，Hansson GK.T lymphocytes in human atherosclerotic plaques are memory cells expressing CD45RO and the integrin VLA-1［J］.Arterioscler Thromb，1992，12( 2) : 206-211.

［3］Liu X，Li H，Ren X.Signaling cascades initiated by tslp-mediated signals in different cell types［J］.Cell Immunol，2012，279: 174-179.

［4］Kolls JK，Lindén A.Interleukin-17 family members and inflammation［J］.Immunity，2004，21( 4) : 467-476.

［5］Liu Z，Lu F，Pan H，et al.Correlation of peripheral th17 cells and th17-associated cytokines to the severity of carotid artery plaque and its clinical implication［J］.Atherosclerosis，2012，221( 1) : 232-241.

［6］Usui F，Kimura H，Ohshiro T，et al.Interleukin-17 deficiency reduced vascular inflammation and development of atherosclerosis in western diet-induced apoe-deficient mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，420( 1) : 72-77.

［7］Gao Q，Jiang Y，Ma T，et al.A critical function of th17 proinflammatory cells in the development of atherosclerotic plaque in mice［J］.J Immunol，2010，185( 10) : 5820-5827.

［8］Takai T.Tslp expression: Cellular sources，triggers，and regulatory mechanisms［J］.Allergol Int，2012，61( 1) : 613-617.

［9］Zhao H，Li M，Wang L，et al.Angiotensin ii induces tslp via an at1 receptor/nf-kappab pathway，promoting th17 differentiation ［J］.Cell Physiol Biochem，2012，30( 6) : 1383-1397.

［10］Haro H，Komori H，Okawa A，et al.Sequential dynamics of monocyte chemotactic protein-1 expression in herniated nucleus pulposus resorption［J］.J Orthop Res，1997，15( 5) : 734-741

［11］Kanamaru Y，Sumiyoshi K，Ushio H，et al.Smad3 deficiency in mast cells provides efficient host protection against acute septic peritonitis［J］.J Immunol，2005，174( 7) : 4193-4197.

［12］Tanaka J，Watanabe N，Kido M，et al.Human tslp and tlr3 ligands promote differentiation of th17 cells with a central memory phenotype under th2-polarizing conditions［J］.Clin Exp Allergy，2009，39( 1) : 89-100.

收稿日期:( 2015-06-05)

通信作者簡介:梁磊( 1974-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化分子生物學(xué)機(jī)制。E-mail: ll008@163.com

作者簡介:第一林靜( 1979-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制。E-mail: linjing.123456789@163.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 81400333)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015)29-0004-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R311.1+44

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.29.002