靜態(tài)頂空-氣相色譜法用于柳葉蠟梅揮發(fā)油指紋圖譜研究

梁現(xiàn)蕊，肖欽欽

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：建立柳葉蠟梅揮發(fā)油的氣相色譜指紋圖譜分析方法,為全面控制柳葉蠟梅質(zhì)量提供參考.采用HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm × 0.50 μm)，頂空平衡溫度80 ℃，頂空平衡時(shí)間50 min，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃，程序升溫靜態(tài)頂空-氣相色譜(HS-GC)分析條件，對(duì)12批柳葉蠟梅樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，標(biāo)定了25個(gè)共有峰,結(jié)合相似度軟件、聚類(lèi)分析和主成分分析對(duì)12批樣品進(jìn)行系統(tǒng)的比較與歸類(lèi),將不同批次的柳葉蠟梅樣品分為兩類(lèi).該方法精密度好，簡(jiǎn)單快速，為柳葉蠟梅品種的鑒定與質(zhì)量評(píng)估提供了可靠的依據(jù).

關(guān)鍵詞：柳葉蠟梅；靜態(tài)頂空-氣相色譜(HS-GC)；指紋圖譜；揮發(fā)油；鑒別

收稿日期：2015-03-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21206148)

作者簡(jiǎn)介：梁現(xiàn)蕊(1975—)，女，山東臨沂人，副教授，博士，主要從事藥物結(jié)構(gòu)分析研究，E-mail: liangxrvicky@zjut.edu.cn.

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-4303(2015)05-0567-06

Abstract:This study aimed to establish a fingerprints analysis method of volatile oil in Chimonanthus salicifolius for quality control by static headspace-gas chromatography (HS-GC). HS-GC analysis was performed on the HP-INNOWAX capillary column (30 m × 0.25 mm × 0.50 μm) with the inlet temperature at 200 ℃ and the FID detector temperature at 250 ℃. The HS oven temperature was 80 ℃, and the vial equilibration time was 50 min. The optimized method was applied to the fingerprints analysis of 12 samples and 25 characteristic peaks were picked out. The data was analyzed by chemometrics methods such as similarity analysis, hierarchical cluster analysis and principal component analysis. 12 samples were divided into 2 groups. A new, rapid and simple HS-GC fingerprint method was developed. It provides a novel strategy for the origin distinction and quality evaluation of Chimonanthus salicifolius.

Keywords:Chimonanthus salicifolius; static headspace-gas chromatography (HS-GC); fingerprints; volatile compounds; authentication

Research on the fingerprints of volatile oil inChimonanthussalicifolius

by static headspace-gas chromatography

LIANG Xianrui, XIAO Qinqin

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

柳葉蠟梅(Chimonanthussalicifolius)系蠟梅科蠟梅屬半常綠灌木川，在我國(guó)具有悠久的栽培歷史和藥用價(jià)值，其產(chǎn)地主要分布于我國(guó)江西和浙江等省[1].用柳葉蠟梅的葉片和嫩芽為原料制成的綠茶，在浙江麗水和江西婺源一帶被稱(chēng)作“食涼茶”或“黃金茶”，具有抗菌，消炎等作用，同時(shí)對(duì)防治感冒、喉嚨腫痛、慢性氣管炎等也有較好的療效[2-4].此外，柳葉蠟梅中含有豐富的揮發(fā)油成分，因此它將是精油生產(chǎn)的一個(gè)重要來(lái)源[4-5].然而，對(duì)于蠟梅屬品種的分類(lèi)研究，一直以來(lái)都存在不同的爭(zhēng)議.目前，蠟梅屬在我國(guó)中部和東南部就已有十種之多[6]，如蠟梅、山蠟梅、柳葉蠟梅、西南蠟梅、貴州蠟梅、浙江蠟梅、突托蠟梅、保康蠟梅、安徽蠟梅、簇花蠟梅.由于蠟梅品種具有十分相似的外觀和香味等特點(diǎn)，因此很難通過(guò)其外在形態(tài)或氣味將其一一區(qū)別開(kāi)來(lái).因此，作為一種重要的中藥材使用時(shí)，需要建立一個(gè)準(zhǔn)確的方法來(lái)區(qū)分這些品種，以避免造假和誤用，同時(shí)也為其產(chǎn)地識(shí)別提供科學(xué)依據(jù).

目前，指紋圖譜技術(shù)是國(guó)際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的最常用手段，是一種綜合的可量化的鑒定手段[7].但中藥的指紋圖譜相當(dāng)復(fù)雜，為了能最大限度地獲取有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)的化學(xué)信息，常常將其與化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，其應(yīng)用更為準(zhǔn)確可靠.其中，相似度評(píng)價(jià)、主成分分析與聚類(lèi)分析在中藥指紋圖譜研究中最常使用.相似度評(píng)價(jià)是通過(guò)將譜學(xué)分析法與化學(xué)計(jì)量學(xué)處理方法相結(jié)合，建立藥材的特征性指紋圖譜，以其特征峰為依據(jù)對(duì)樣本進(jìn)行分類(lèi)的一種數(shù)據(jù)分析技術(shù)，采用色譜峰面積為分析對(duì)象，保持了藥材多成分信息的完整性，可為藥材品質(zhì)鑒定提供了較詳細(xì)的信息，是指紋圖譜用于藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制的一個(gè)重要環(huán)節(jié).主成分分析是利用降維的思想，根據(jù)貢獻(xiàn)率的大小用少數(shù)幾個(gè)具有代表性的綜合指標(biāo)去解釋原來(lái)資料中的大部分變量的多元統(tǒng)計(jì)分析方法.聚類(lèi)分析又稱(chēng)群分析，是根據(jù)“物以類(lèi)聚”的道理，對(duì)樣品或指標(biāo)進(jìn)行分類(lèi)的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法.化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛地運(yùn)用于中藥指紋圖譜的研究[8-11].靜態(tài)頂空-氣相色譜采用氣體進(jìn)樣方式，其分析速度快，操作簡(jiǎn)便，幾乎不需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理就可以直接對(duì)液體或固體樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析[12-13].本實(shí)驗(yàn)旨在應(yīng)用靜態(tài)頂空-氣相色譜建立柳葉蠟梅中易揮發(fā)性成分的分析方法，并結(jié)合相似度分析、聚類(lèi)分析和主成分分析對(duì)不同產(chǎn)地、采收時(shí)間的柳葉蠟梅中易揮發(fā)性成分進(jìn)行指紋圖譜分析，從而為柳葉蠟梅的質(zhì)量鑒定及產(chǎn)地判別提供依據(jù).

1儀器與材料

1.1儀器與設(shè)備

Mettler toledo XS205DU天平(瑞士)；Agilent Technologies 6890N氣相色譜儀(美國(guó))，配有FID檢測(cè)器、安捷倫化學(xué)工作站及Agilent Technologies Agilent G1888頂空進(jìn)樣器；Agilent Technologies 7890A氣相色譜-四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有EI源、MassHunter數(shù)據(jù)軟件、NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù).

1.2試劑與材料

α-蒎烯對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%)，購(gòu)于廣東松林香料有限公司.

柳葉蠟梅樣品分別采自于江西、浙江等地，12批樣品信息如表1所示，所有樣品經(jīng)研磨、粉碎和過(guò)篩后放入干燥潔凈的樣品瓶中，保存于2～8 ℃冰箱中備用.

表1　12批柳葉蠟梅茶葉樣品信息

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1色譜條件

2.1.1HS-GC條件

色譜柱為毛細(xì)管色譜柱HP-INNOWAX(30 m×0.32 mm×0.5 μm)；載氣：高純氮?dú)猓魉?.0 mL/min；柱溫：程序升溫，初始溫度50 ℃保持3 min，以10 ℃/min的速率升溫至150 ℃，保持10 min，再以1 ℃/min的速率升溫至160 ℃，保持6 min，最后以20 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持17 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；FID檢測(cè)器溫度為280 ℃；不分流模式；頂空瓶體積20 mL；頂空平衡溫度為80 ℃；頂空平衡時(shí)間50 min；進(jìn)樣時(shí)間為1 min.

2.1.2HS-GC/MS條件

色譜柱為毛細(xì)管色譜柱HP-INNOWAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度為200 ℃，載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣時(shí)間1 min，EI源溫度230 ℃，電壓70 eV，質(zhì)量掃描范圍30～550 amu，程序升溫和頂空條件同2.1.1.

2.2對(duì)照品溶液的制備

取α-蒎烯對(duì)照品5 mg，精密稱(chēng)定，至于50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度.精密量取上述溶液0.2 mL至20 mL頂空瓶中，加入1.8 mL水，壓蓋密封，即得.

2.3供試品溶液的制備

取柳葉蠟梅粉末300 mg，精密稱(chēng)定，置于20 mL頂空瓶中,加水2 mL,壓蓋密封，即得供試品溶液.

3結(jié)果與討論

3.1方法重復(fù)性、精密度和柳葉蠟梅供試品穩(wěn)定性

取S3批次柳葉蠟梅樣品6份，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1.1 HS-GC條件進(jìn)樣測(cè)定進(jìn)行重復(fù)性考察.結(jié)果顯示25個(gè)共有峰的峰面積RSD在3.3%～4.9%范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法重復(fù)性好.取同一批次樣品5份，分別于第1天和第2天進(jìn)行試驗(yàn)，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1.1 HS-GC條件進(jìn)樣測(cè)定進(jìn)行精密度考察.結(jié)果顯示25個(gè)共有峰的峰面積RSD(n=10)在2.4%～5.0%范圍內(nèi)，說(shuō)明儀器精密度良好.取同一批次樣品8份，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1.1 HS-GC條件，分別在0，2，4，8，12，20，24和48 h進(jìn)樣測(cè)定進(jìn)行穩(wěn)定性考察.結(jié)果表明：柳葉蠟梅供試品溶液在24 h內(nèi)25個(gè)共有峰的峰面積RSD均小于5.0%，但從色譜圖上來(lái)看，樣品在20 h后出現(xiàn)了兩個(gè)新物質(zhì)，因此樣品溶液在20 h內(nèi)是穩(wěn)定的.

3.2指紋圖譜的建立

3.2.1指紋圖譜共有模式的建立及相似度評(píng)價(jià)

取12批柳葉蠟梅樣品，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1.1 HS-GC條件依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄GC色譜圖，12批樣品的GC色譜圖如圖1所示.將12批柳葉蠟梅揮發(fā)油的GC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004 A版)進(jìn)行分析，以S1批柳葉蠟梅GC譜圖為參照譜圖進(jìn)行指紋匹配，確定了25個(gè)共有峰，生成共有模式指紋圖譜，如圖2所示，其中，以峰18在圖譜中較穩(wěn)定，峰面積較大，與各峰分離良好，又為所有樣品共有，因此確定峰18為參照峰(S)，則其余各共有峰與峰18的相對(duì)保留時(shí)間RSD見(jiàn)表2.同時(shí)進(jìn)行各批次樣品與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度計(jì)算，以?shī)A角余弦法為測(cè)度，12批樣品相似度結(jié)果依次為：0.964，0.879，0.745，0.870，0.931，0.967，0.897，0.912，0.936，0.916，0.995，0.903.

圖1　12批柳葉蠟梅揮發(fā)油的HS-GC指紋圖譜 Fig.1　HS-GC fingerprint of 12 batches of volatile oil in Chimonanthus salicifolius

圖2　柳葉蠟梅揮發(fā)油的HS-GC指紋圖譜共有模式及共有峰標(biāo)識(shí) Fig.2　Mutual modes and common peaks of HS-GC fingerprint of volatile oil in Chimonanthus salicifolius

編號(hào)相對(duì)保留時(shí)間S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12RSD/%10.2730.2730.2730.2730.2740.2730.2730.2740.2730.2730.2730.2730.09020.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.2930.07230.3450.3460.3460.3460.3460.3460.3460.3460.3460.3460.3460.3460.04040.3720.3720.3720.3720.3730.3720.3720.3720.3720.3720.3720.3720.04750.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.3820.04160.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.04570.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.4360.04380.4560.4540.4550.4560.4530.4540.4550.4540.4550.4550.4560.4560.24490.4660.4640.4650.4660.4630.4640.4660.4640.4650.4650.4660.4660.233100.5010.4990.5000.5010.4980.4990.5000.4990.5000.5000.5010.5010.248110.5450.5430.5440.5440.5420.5430.5440.5430.5440.5440.5440.5440.171120.5600.5590.5600.5600.5590.5590.5600.5590.5590.5600.5600.5600.065130.5880.5870.5880.5880.5860.5860.5880.5870.5870.5880.5880.5880.112140.7770.7780.7760.7760.7770.7750.7760.7780.7760.7780.7760.7760.117150.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.8400.019160.8940.8940.8930.8940.8940.8940.8930.8940.8930.8940.8940.8940.047170.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.9680.013181.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.000191.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1361.1360.013201.2191.2201.2151.2191.2201.2191.2191.2191.2191.2191.2191.2190.098211.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2381.2380.016221.2791.2801.2801.2791.2791.2791.2791.2801.2791.2791.2791.2790.039231.3201.3201.3201.3201.3201.3191.3201.3201.3191.3201.3191.3190.028241.3371.3371.3371.3371.3371.3371.3381.3371.3361.3371.3371.3370.030252.1622.1632.1642.1632.1642.1632.1632.1622.1632.1622.1632.1630.034

一般情況下，當(dāng)相似性低于0.800，認(rèn)為兩個(gè)樣品之間有很大的不同.因此，從相似度結(jié)果來(lái)看，采收年份最早的S3與其他樣品差異較大，說(shuō)明采收年份對(duì)柳葉臘梅揮發(fā)油成分有一定的影響.對(duì)于同一地區(qū)的樣品，產(chǎn)自江西的5批樣品之間質(zhì)量差異較小，產(chǎn)自浙江開(kāi)化的7批樣品之間相似性差異也較小，除S3.通常，樣品中的揮發(fā)性成分易受儲(chǔ)藏條件與存放時(shí)間的影響而導(dǎo)致其某些揮發(fā)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化[7,11]，同時(shí)也受采收時(shí)間的影響，如S3批樣品因采收時(shí)間早于所有其他批次的樣品，且一直存放于室溫條件下而導(dǎo)致其與其他批次樣品差距較大.

3.2.2共有峰的歸屬

取S1批柳葉蠟梅樣品，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1.2 HS-GC/MS條件進(jìn)樣分析，采用對(duì)照品對(duì)照與NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)柳葉蠟梅揮發(fā)油指紋圖譜中的25個(gè)共有色譜峰進(jìn)行歸屬.各共有峰經(jīng)HS-GC/MS鑒定結(jié)果示見(jiàn)表3，譜庫(kù)檢索匹配度均大于90%，因此柳葉蠟梅茶葉中主要含有α-蒎烯、桉油精、石竹烯、α-石竹烯、D-大根香葉烯和(-)-b-杜松烯等揮發(fā)性成分.從表3中可看出：12批樣品25個(gè)共有特征峰的相對(duì)峰面積(以峰18為參照峰)變化較大，表明不同批次柳葉和蠟梅之間化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定差異.

表3　柳葉蠟梅指紋圖譜共有峰的成分分析

3.3聚類(lèi)分析

為了能更全面地了解柳葉蠟梅樣品的質(zhì)量和品種之間的差異性，以柳葉蠟梅GC圖譜中25個(gè)特征峰的相對(duì)峰面積(以峰18為參照峰)為指標(biāo)，采用SPSS19.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)12批柳葉蠟梅樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析.將相似度分析所得12批樣品的匹配數(shù)據(jù)中25個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積導(dǎo)入該軟件中，得到一個(gè)A12×25(12批樣品和25個(gè)共有峰)的數(shù)據(jù)矩陣.聚類(lèi)分析采用組間聯(lián)接法，平方Euclidean距離作為聚類(lèi)對(duì)象相似度的距離公式，得到柳葉蠟梅樣品系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)狀圖如圖3所示，從圖3中可清楚地看出：S3批樣品與其他批次距離較遠(yuǎn)，若將12批樣品分為兩大類(lèi)，則S3可為第Ι類(lèi)，其他11批樣品可為ΙΙ類(lèi).兩個(gè)樣本之間的距離越短，它們的相似度就越高，質(zhì)量差異就越小.因此，該結(jié)果表明S3批次樣品與其他批次樣品的質(zhì)量之間存在明顯差異，這與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果是一致的.

圖3　12批柳葉蠟梅樣品使用平均聯(lián)接的樹(shù)狀圖 Fig.3　Dendrogram clustering of 12 Chimonanthus salicifolius samples

3.4主成分分析

以柳葉蠟梅GC圖譜中25個(gè)特征峰的相對(duì)峰面積為指標(biāo)，采用SPSS19.0軟件對(duì)12批柳葉蠟梅樣品進(jìn)行主成分分析.基于特征值>1為抽取標(biāo)準(zhǔn)，得到前兩個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為92.0%(第一主成分的貢獻(xiàn)率為82.4%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為9.6%)，它代表了柳葉蠟梅樣品中25個(gè)元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的92.0%的信息量，具有較好的代表性，說(shuō)明主成分分析法在該研究中適用，降維成功，因此選取前2個(gè)主成分即可進(jìn)行評(píng)價(jià).12批柳葉蠟梅樣品的主成分得分圖如圖4所示，依據(jù)各樣品在主成分得分散點(diǎn)圖上的位置，我們同樣可以看到點(diǎn)S3與其他多點(diǎn)聚集中心的距離偏離較遠(yuǎn)，因此，該結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果是一致的.

圖4　12批柳葉蠟梅樣品的主成分得分圖 Fig.4　Scatter plot of 12 Chimonanthus salicifolius samples

4結(jié)論

應(yīng)用靜態(tài)頂空-氣相色譜法建立了柳葉蠟梅揮發(fā)油的專(zhuān)屬性指紋圖譜，該方法簡(jiǎn)單快速，無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，樣品用量少，精密度好，可用于柳葉蠟梅揮發(fā)油的指紋圖譜分析.結(jié)合相似度分析、聚類(lèi)分析和主成分分析等方法，對(duì)12批樣品的質(zhì)量進(jìn)行了系統(tǒng)比較與分類(lèi)研究，結(jié)果表明：12柳葉蠟梅樣品可分為兩大類(lèi)，其中采收年份最早的S3批樣品為第Ι類(lèi)，其他11批樣品為第ΙΙ類(lèi)，說(shuō)明不同產(chǎn)地的柳葉蠟梅之間質(zhì)量差異較小，而采收時(shí)間與存放時(shí)間對(duì)其質(zhì)量影響較為明顯，三種分析方法得到一致的結(jié)論，說(shuō)明建立的柳葉蠟梅揮發(fā)油的指紋圖譜分析方法可靠，可為柳葉蠟梅的香氣評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制和產(chǎn)地識(shí)別等方面提供科學(xué)依據(jù).

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(責(zé)任編輯：劉巖)