劉青++李朝煒++朱昀等

摘要：以粳糯型常規(guī)旱稻品種“冀旱糯3號(hào)”為受體材料，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將bar基因和lea-1基因轉(zhuǎn)入旱稻細(xì)胞，建立了適用于旱稻的高效轉(zhuǎn)化體系，最終獲得轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明：當(dāng)農(nóng)桿菌濃度（以D600 nm表示）為0.2時(shí)，轉(zhuǎn)化效果最好。在篩選抗性愈傷時(shí)，除草劑的最佳濃度為40 mg/L，對(duì)抗性愈傷組織進(jìn)行預(yù)分化能提高其分化率，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測(cè)，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化率提高到37.5%。

關(guān)鍵詞：旱稻；除草劑；農(nóng)桿菌；PCR；lea基因

中圖分類號(hào)： Q785；S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0042-03

收稿日期：2014-11-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（編號(hào)：2011ZX08001-003）。

作者簡(jiǎn)介：劉青（1989—），女，碩士研究生，主要從事生物工程方面的研究工作。E-mail：liuqing12151118@163.com。

通信作者：魏景芳，博士，教授，主要從事植物細(xì)胞工程方面的教學(xué)與研究工作。E-mail：wjfang@126.com。近年來(lái)，全球水資源短缺已成為限制工農(nóng)業(yè)及人類生活發(fā)展的一大因素，而旱作農(nóng)業(yè)成為解決水資源短缺問(wèn)題的關(guān)鍵。旱稻在糧食作物中至關(guān)重要，需水量少，抗旱性強(qiáng)，與水稻相比具有許多優(yōu)勢(shì)，是推行旱作農(nóng)業(yè)最佳的糧食作物之一[1]。本研究利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將bar基因和lea-1基因轉(zhuǎn)入冀旱糯3號(hào)愈傷組織中，培育出抗旱抗鹽抗除草劑旱稻新品種，解決了旱稻種植時(shí)田間雜草和土壤干旱的問(wèn)題，大大降低了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，從而可以大面積種植旱稻。bar基因是目前抗除草劑基因工程研究中應(yīng)用最為廣泛的一個(gè)基因，也是迄今為止用得最多的一個(gè)抗除草劑選擇標(biāo)記基因，已成功用于小麥[2]、水稻[3]、玉米[4]、油菜[5]等作物中。lea-1基因是目前常用的一種抗旱基因，lea-1基因轉(zhuǎn)錄翻譯出LEA蛋白的特殊結(jié)構(gòu)可作為脫水保護(hù)劑，能部分替代水分子，保持細(xì)胞液處于溶解狀態(tài)，穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)蛋白和分子伴侶參與植物滲透調(diào)節(jié)，在水分脅迫時(shí)穩(wěn)定和保護(hù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能，可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)水的保持能力[6]。俞嘉寧等在2004年在小麥中克隆了1個(gè)第三組lea基因Ta-LEA3，研究發(fā)現(xiàn)小麥中該基因的表達(dá)與其抗旱性呈正相關(guān)[7]。Cheng等將小麥中LEA蛋白PMA1959基因轉(zhuǎn)化水稻，在干旱脅迫或鹽脅迫復(fù)水后，第二代植株的干鮮質(zhì)量均高于對(duì)照組[8]。本試驗(yàn)將抗草銨膦bar基因作為選擇標(biāo)記基因，抗旱基因lea-1作為目的基因轉(zhuǎn)入冀旱糯3號(hào)細(xì)胞中，建立成熟完善高效的旱稻轉(zhuǎn)化體系，提高旱稻的轉(zhuǎn)化率，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1材料和方法

1.1旱稻材料

供式材料為粳糯型常規(guī)旱稻品種冀旱糯3號(hào)種子。

1.2基因

lea-1基因載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。農(nóng)桿菌菌株Agl-1，轉(zhuǎn)化載體為pCAMBIA3301，其中含有小立碗蘚胚胎晚期豐富蛋白LEA（Late embryogenesis abundant protein）基因，basta抗性基因，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所路鐵鋼老師惠贈(zèng)。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1細(xì)菌培養(yǎng)基YEB：5 g/L牛肉浸膏+1 g/L酵母膏+5 g/L蛋白胨+5 g/L氯化鈉，pH值7.4。AAM：AAM大量+AAM微量+MS有機(jī)+鐵鹽+肌醇+0.3 g/L水解酪蛋白+68.5 g/L蔗糖+36 g/L葡萄糖，pH值5.2。

1.3.2愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基/愈傷組織繼代培養(yǎng)基N6大量+B5微量+B5有機(jī)+麥芽糖3%+肌醇+水解酪蛋白0.3 g/L+精氨酸0.174 g/L+天冬氨酸0.266 g/L+谷氨酰胺0.876 g/L+2，4-D 2 mg/L+凝膠0.58%，pH值5.8。

1.3.3農(nóng)桿菌共培養(yǎng)培養(yǎng)基N6大量+B5微量+B5有機(jī)+鐵鹽+2，4-D+肌醇+水解酪蛋白0.3 g/L+蔗糖30 g+葡萄糖10 g+AS 20 mg/L，pH值5.2。

1.3.4恢復(fù)培養(yǎng)基N6大量+B5微量+B5有機(jī)+蔗糖3%+肌醇+鐵鹽+水解酪蛋白0.3 g/L+脯氨酸0.5 g/L+特美汀500 mg/L+凝膠0.58%，pH值6.0。

1.3.5抗性愈傷篩選培養(yǎng)基N6大量+B5微量+B5有機(jī)+蔗糖3%+肌醇+鐵鹽+水解酪蛋白0.3 g/L+脯氨酸0.5 g/L+特美汀300 mg/L+草銨膦30 mg/L+凝膠0.58%，pH值6.0。

1.3.6抗性愈傷預(yù)分化培養(yǎng)基N6大量+MS微量+B5有機(jī)+NAA 1 mg/L+6-BA 3 mg/L+ABA 3 mg/L+蔗糖 3%+鐵鹽+水解酪蛋白0.5 g/L+肌醇+特美汀300 mg/L+草銨膦30 mg/L+凝膠0.58%，pH值6.0。

1.3.7抗性愈傷分化培養(yǎng)基N6大量+B5微量+B5有機(jī)+6-BA 1 mg/L+NAA 1 mg/L+肌醇+鐵鹽+水解酪蛋白0.3 g/L+蔗糖3%+植物凝膠，pH值5.8。

1.3.8生根壯苗培養(yǎng)基1/2MS+蔗糖3%+NAA 0.5 mg/L+植物凝膠0.28%，pH值5.8。

1.4旱稻愈傷組織培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，用75%乙醇浸泡已脫殼種子2 min，用蒸餾水洗滌3次，30%NaClO浸泡40 min，冀旱糯3號(hào)種子較其他旱稻種子相比更易染菌，所以浸泡過(guò)程中應(yīng)不斷搖晃錐形瓶，浸泡后用蒸餾水洗滌3次，重復(fù)1次；用無(wú)菌濾紙吸干種子表面水分，無(wú)菌條件下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在28 ℃黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織；培養(yǎng)7 d待少量愈傷長(zhǎng)出后，進(jìn)行切芽，切芽后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 d后挑選致密、狀態(tài)佳的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻

1.5.1農(nóng)桿菌的培養(yǎng)將Agl-1農(nóng)桿菌菌種（含有l(wèi)ea及bar基因）涂布于固體YEP培養(yǎng)基（含有50 mg/L硫酸卡那霉素和50 mg/L利福平）的培養(yǎng)皿中，28 ℃過(guò)夜暗培養(yǎng)3 d，從培養(yǎng)皿上刮取適量長(zhǎng)出的農(nóng)桿菌懸浮于液體AAM培養(yǎng)基中（內(nèi)含終濃度為60 mg/L的乙酰丁香酮）以備轉(zhuǎn)化之用。

1.5.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化為了確定轉(zhuǎn)化侵染時(shí)合適的菌液濃度，需要比較不同濃度菌液對(duì)愈傷轉(zhuǎn)化效率的影響，挑選生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，分別放入600 nm處吸光度為0.1、0.2、0.3的AAM菌懸液中浸染，不斷輕輕振搖20 min后，倒掉菌液，將愈傷組織置于無(wú)菌濾紙上吸干。用小勺將表面干燥的愈傷均勻撒在鋪有1張無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基，恢復(fù)培養(yǎng)基中不含篩選劑，主要作用是抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。

1.6篩選

愈傷組織在恢復(fù)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5 d后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，為了確定轉(zhuǎn)化篩選時(shí)合適的除草劑濃度，需要比較不同濃度除草劑對(duì)水稻愈傷生長(zhǎng)的影響，將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的淡黃色、干爽且呈顆粒狀的愈傷組織分別轉(zhuǎn)入含20、40、60 mg/L草銨膦的培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)基中接10板愈傷組織，28 ℃暗培養(yǎng)15 d后，觀察記錄愈傷組織的生長(zhǎng)、褐化、死亡情況。

1.7抗性愈傷組織獲得、分化、幼苗生根及移栽

將愈傷組織轉(zhuǎn)接于篩選培養(yǎng)基篩選2輪，每輪15 d。挑選出淺色抗性愈傷組織接到預(yù)分化培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)5～7 d，直到抗性愈傷組織變白。將變白的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，28 ℃下光照培養(yǎng)30 d左右，待其出現(xiàn)綠點(diǎn)；當(dāng)綠點(diǎn)分化成3 cm左右的芽時(shí)，將芽轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基，25 ℃光照培養(yǎng)3周左右，最后將苗移栽至大田。

1.8抗性植株的分子檢測(cè)

按Edwards等的方法[9]提取待測(cè)的葉片總DNA。引物設(shè)計(jì)：遵循引物設(shè)計(jì)原則，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)PCR檢測(cè)引物，引物序列如下：F：5′-AATTTCTTTCTTTTTGGATTA 3′，R：5′-TGCGGTGTCTTATTTACTAT 3′。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：DNA 2 μL，dNTPMix 1 μL，10×PCR buffer 2 μL，Taq酶0.2 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，補(bǔ)水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：96 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.9數(shù)據(jù)處理

對(duì)轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR結(jié)果進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)基因的轉(zhuǎn)化情況。轉(zhuǎn)化率各指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)參照文獻(xiàn)[10]。綠苗分化率=分化綠苗數(shù)/感染愈傷組織數(shù)×100%；假陽(yáng)性率=（綠苗數(shù)-PCR陽(yáng)性植株數(shù)）/綠苗數(shù)×100%；轉(zhuǎn)化率=PCR陽(yáng)性植株株數(shù)/感染愈傷組織數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1愈傷組織的誘導(dǎo)

本研究得出，不含脯氨酸的NB培養(yǎng)基比水稻常用的MS培養(yǎng)基效果更好，將常用碳源蔗糖改為麥芽糖更有利于誘導(dǎo)旱稻愈傷組織。在培養(yǎng)基中添加2 mg/L 2，4-D，能使愈傷生長(zhǎng)為最適宜轉(zhuǎn)化的粟粒大小，接種7 d后進(jìn)行切芽，否則產(chǎn)生的大量根會(huì)影響愈傷組織的生長(zhǎng)。20 d后待愈傷長(zhǎng)至圖2的狀態(tài)時(shí)進(jìn)行繼代。

2.2農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，600 nm處吸光度為0.1、0.2的菌液侵染后比較容易脫菌，而吸光度為0.3的菌液侵染的愈傷組織脫菌后農(nóng)桿菌會(huì)再次生長(zhǎng)（圖3）。但吸光度為0.1的菌液侵染的愈傷組織在后期篩選過(guò)程中死亡率較高，菌液濃度過(guò)低會(huì)降低轉(zhuǎn)化率。故本試驗(yàn)采用吸光度為0.2的菌液進(jìn)行侵染。

2.3篩選劑用量的選擇

將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織恢復(fù)5～7 d后在不同篩選濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，統(tǒng)計(jì)死亡率，20、40、60 mg/L草銨膦處理死亡率分別為11%、27%、60%。除草劑對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用，隨著濃度的升高，抑制效果逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度為20 mg/L時(shí)，愈傷組織死亡率只有11%，褐化現(xiàn)象不明顯（圖4-A）；當(dāng)濃度為40 mg/L時(shí)，愈傷組織明顯褐化，死亡率也大幅提升。所以，為了能有效區(qū)分轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，降低轉(zhuǎn)基因植株的假陽(yáng)性率，本試驗(yàn)除草劑（草銨膦）濃度采用40 mg/L。把轉(zhuǎn)化后的愈傷組織轉(zhuǎn)到含40 mg/L除草劑的選擇培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)15 d篩選，觀察發(fā)現(xiàn)有小部分愈傷組織全部褐化死亡；有些愈傷組織部分褐化，表面松散，雖然沒(méi)有徹底死亡，但是沒(méi)有長(zhǎng)出乳白色的抗性愈傷組織；另有一部分愈傷組織雖然母體褐化，但在生長(zhǎng)點(diǎn)長(zhǎng)出抗性愈傷組織（圖4-B）。對(duì)于最佳篩選劑濃度的確定，要遵循一個(gè)原則：既要抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)，又不會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞造成太大損害。本試驗(yàn)采用的除草劑濃度為40 mg/L，低于這個(gè)濃度，大部分愈傷組織得不到控制，很難區(qū)分轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，造成大量假陽(yáng)性；高于這個(gè)濃度，則轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)也容易被抑制，從而不容易分化。篩選過(guò)程為2輪，每輪15 d，由于冀旱糯3號(hào)的抗性愈傷組織在篩選過(guò)程中生長(zhǎng)良好，優(yōu)于其他旱稻品種，無(wú)需第3輪篩選。

2.4預(yù)分化對(duì)分化率的影響

將篩選出的一部分抗性愈傷組織直接接到分化培養(yǎng)基上，分化率為38%，而先經(jīng)過(guò)預(yù)分化再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基的分化率為56%，后者較優(yōu)，并且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冀旱糯3號(hào)的分化率

普遍高于鯤旱1號(hào)等其他旱稻品種。

通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)預(yù)分化的愈傷組織為白色胚狀顆粒，且顏色鮮亮有光澤，在分化培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，長(zhǎng)勢(shì)較好，未經(jīng)預(yù)分化的愈傷組織顏色發(fā)黃暗淡，生長(zhǎng)較慢，容易褐化。分化20 d后觀察，經(jīng)過(guò)預(yù)分化的愈傷組織在分化過(guò)程中的綠點(diǎn)率高于未經(jīng)預(yù)分化的愈傷組織，并且部分愈傷已分化出苗（圖5）?？梢?jiàn)，篩選出的抗性愈傷組織在分化之前先經(jīng)過(guò)預(yù)分化處理可提高分化率。

由于預(yù)分化培養(yǎng)基中含有植物內(nèi)源激素脫落酸（ABA）[11]，脫落酸是有關(guān)生長(zhǎng)活性物質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子，可具有促進(jìn)植物吸收營(yíng)養(yǎng)和協(xié)調(diào)體內(nèi)代謝的能力，故本試驗(yàn)在預(yù)分化培養(yǎng)基中加入ABA可有助于愈傷組織分化。

2.5T0代轉(zhuǎn)化苗PCR反應(yīng)結(jié)果

提取轉(zhuǎn)化苗葉片DNA并進(jìn)行PCR檢測(cè)，由圖6可見(jiàn)，3～21號(hào)泳道有條帶，并且和作為陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)粒DNA片段大小一致，說(shuō)明這20個(gè)樣品中含有目的基因，可以確定是陽(yáng)性植株。將擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI比對(duì)，結(jié)果表明出自小立腕蘚的lea-1基因已成功轉(zhuǎn)化。

2.6數(shù)據(jù)處理結(jié)果

計(jì)算得：綠苗分化率41.2%，假陽(yáng)性率9.1%，轉(zhuǎn)化率37.5%。

3結(jié)論與討論

冀旱糯3號(hào)為粳糯型旱稻新品種，其轉(zhuǎn)化體系與普通旱稻（如鯤旱1號(hào)）有一定區(qū)別。本試驗(yàn)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)牒档局?，建立了適用于冀旱糯3號(hào)的高效轉(zhuǎn)化體系，確定了最適宜的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NB+2，4-D（不加脯氨酸），糖源改為麥芽糖，最佳菌液侵染濃度（以D600 nm表示）為0.2，篩選培養(yǎng)基中除草劑最佳濃度為40 mg/L，將篩選出的乳白色抗性愈傷組織經(jīng)過(guò)5d預(yù)分化培養(yǎng)，可提高分化

效率。本試驗(yàn)提取轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA并進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，利用優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化體系可將轉(zhuǎn)化率提高到375%。本研究結(jié)果證明目的基因已成功轉(zhuǎn)入冀旱糯3號(hào)的細(xì)胞中，而目的基因的插入位點(diǎn)還需要進(jìn)一步做tail-PCR研究。

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