MRFs家族基因在鯉魚紅肌和白肌中的表達(dá)差異

張明　呂明　李瑞文等

摘要：為探索生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulator factors，MRFs）家族基因在鯉魚肌纖維形成中的基本作用，利用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)MRFs家族各成員在鯉魚紅肌、白肌中的表達(dá)差異，并與紅肌纖維的標(biāo)志基因MyHCⅠ及白肌纖維的標(biāo)志基因MyHCⅡ的表達(dá)水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，MyoD基因在鯉紅肌中的表達(dá)極顯著高于在白肌中的表達(dá)，并與MyHCⅠ基因的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，Myf6在鯉魚白肌中的表達(dá)極顯著高于其在紅肌中的表達(dá)水平，并與MyHCⅡ基因的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，Myf5、MyoG在鯉魚紅肌、白肌中的表達(dá)水平差異不顯著。

關(guān)鍵詞：MRFs家族基因；紅肌；背肌；腹肌；鯉

中圖分類號(hào)： S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0049-02

收稿日期：2014-11-26

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31201990）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號(hào)：2014JY0088）；西南民族大學(xué)國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：X201410656057）。

作者簡(jiǎn)介：張明（1988—），男，重慶人，從事生物技術(shù)研究。E-mail：zhangmingcoming@163.com。

通信作者：林亞秋，副教授，從事動(dòng)物肉質(zhì)調(diào)控研究。 E-mail：linyq1999@163.com。肌纖維類型及其組成對(duì)動(dòng)物肉品質(zhì)具有重要影響，肌纖維類型主要包括兩大類：Ⅰ型（紅肌、慢?。?、Ⅱ型（白肌、快肌）肌纖維。不同類型肌纖維特性不同（如收縮功能、線粒體成分、代謝特性等），進(jìn)而導(dǎo)致肌肉品質(zhì)存在差別[1-2]。研究表明，若肌肉中紅肌纖維比例高于白肌纖維，則肌肉的品質(zhì)較好[3-4]。Toniolo等將肌球蛋白重鏈 （myosin heavy chain，MyHC） 基因的同工型作為肌纖維類型的分子標(biāo)志[5]。生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulator factors，MRFs） 家族基因在動(dòng)物肌纖維的形成、分化中具有重要的調(diào)控作用，該家族編碼MyoD1、Myf5、MyoG、Myf6等4種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子具有不同的時(shí)空表達(dá)特性[6-8]。本研究利用熒光定量PCR技術(shù)分析生肌調(diào)節(jié)因子家族MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6基因在鯉魚紅肌、白?。ū臣　⒏辜。┲械谋磉_(dá)差異，并與紅肌、白肌纖維標(biāo)志基因MyHCⅠ、MyHCⅡ的表達(dá)水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，初步確定該家族基因在鯉魚肌纖維形成中的作用，旨在為通過肌纖維類型調(diào)控魚類肉質(zhì)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品的采集

所用鯉魚購自西北農(nóng)林科技大學(xué)安康水產(chǎn)試驗(yàn)示范站。選擇體質(zhì)量為500 g左右的成年鯉魚6尾，致死后迅速取其背部紅肌、背肌、腹肌組織，用錫箔紙包好，置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2主要試劑

TRIzol總RNA提取試劑盒與SYBRPremix Ex TaqTM （2×）均購自大連TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶均購自Fermentas公司；DEPC原液由Sigma公司分裝。

1.3方法

1.3.1鯉魚紅肌、白肌組織總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄取出備用的鯉魚紅肌、白肌組織，按照TRIzol試劑盒說明書的方法提取肌肉組織的RNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法，取1 g總RNA，以O(shè)ligo （dT） 為引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。

1.3.2引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上登陸的β-actin、MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6、MyHCⅠ、MyHCⅡ序列（表1），利用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)這些基因的特異引物用來擴(kuò)增在鯉魚紅肌、白肌中的表達(dá)差異。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用熒光定量PCR檢測(cè)MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6、MyHCⅠ、MyHCⅡ基因在鯉紅肌、白肌中的表達(dá)水平?？偡磻?yīng)體系為20 μL，其中SYBRPremix Ex TaqTM （2×）PCR 10 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，57.6～62.3 ℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸30 s。

1.3.4數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用ANOVA進(jìn)行差異性顯著檢驗(yàn)分析。熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCT 方法進(jìn)行分析[9]。

2結(jié)果與分析

2.1MyoD、Myf5、MyoG、Myf6基因在鯉魚紅肌、白肌中的表達(dá)差異

熒光定量檢測(cè)MRFs家族基因在鯉魚紅肌、背肌、腹肌中的表達(dá)結(jié)果（圖1至圖4）顯示，MyoD基因在鯉魚紅肌中的表達(dá)水平極顯著高于在背肌、腹肌中的表達(dá)水平。Myf6基因在鯉魚背肌、腹肌中的表達(dá)水平極顯著高于其在紅肌中的表達(dá)水平。Myf5、MyoG基因在鯉魚紅肌與背肌、腹肌中的表達(dá)水平差異不顯著。

2.2MRFs家族基因與肌纖維標(biāo)志基因MyHCⅠ、MyHCⅡ的相關(guān)性

MyoD基因在鯉魚紅肌中的表達(dá)水平與MyHCⅠ基因的表1基因特異引物序列

基因名稱特異引物序列退火溫度表達(dá)呈極顯著正相關(guān)（r=0.908，P<0.01），Myf6在鯉魚白肌中的表達(dá)水平與MyHCⅡ基因的表達(dá)呈極顯著正相關(guān)（r=1.000，P<0.01）。

3結(jié)論與討論

MRFs家族基因都具有典型的堿性螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)，控制著動(dòng)物肌肉發(fā)育的整個(gè)過程（包括成肌細(xì)胞的增殖、分化和肌纖維的形成），是動(dòng)物肌肉發(fā)育過程中重要的正向調(diào)控因子。因此研究其在魚類肌纖維形成中的作用具有重要意義。MRFs家族基因在哺乳動(dòng)物、魚類中的組織分布不同，在哺乳動(dòng)物中僅在肌肉組織中表達(dá)[10-11]，在魚類多種組織中均存在表達(dá)，但主要分布在肌肉組織中[12-14]。生肌調(diào)節(jié)因子在紅肌、白肌中表達(dá)水平的差異對(duì)2種肌肉的肌纖維形成、肌肉生長(zhǎng)率有影響。本研究結(jié)果表明，MyoD基因在鯉魚紅肌中的表達(dá)水平極顯著高于其在白肌（背肌、腹?。┲械谋磉_(dá)水平，并與紅肌纖維的標(biāo)志基因呈顯著正相關(guān)。Myf6基因在鯉魚背肌、腹肌中的表達(dá)水平極顯著高于其在紅肌中的表達(dá)水平，并與白肌纖維的標(biāo)志基因呈顯著正相關(guān)。MyoG、Myf5基因在鯉魚紅肌中的表達(dá)水平與在背肌和腹肌中的表達(dá)水平差異不顯著，可見MyoD可能在鯉魚的紅肌纖維形成中發(fā)揮主要作用，Myf6基因可能在鯉魚的白肌纖維形成中發(fā)揮主要作用。MyoD在嚙齒動(dòng)物的白肌中表達(dá)量較高，Myogenin卻表達(dá)量較低[15]，這與本試驗(yàn)結(jié)果不同，可能具有物種特異性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Berchtold M W，Brinkmeier H，Müntener M. Calcium ion in skeletal muscle：its crucial role for muscle function，plasticity，and disease[J]. Physiological Reviews，2000，80（3）：1215-1265.

[2]Picard B，Jurie C，Duris M P，et al. Consequences of selection for higher growth rate on muscle fibre development in cattle[J]. Livestock Science，2006，102（1/2）：107-120.

[3]Lefaucheur L，Milan D，Ecolan P，et al. Myosin heavy chain composition of different skeletal muscles in Large White and Meishan pigs[J]. Journal of Animal Science，2004，82（7）：1931-1941.

[4]Bowker B C，Botrel C，Swartz D R，et al. Influence of myosin heavy chain isoform expression and postmortem metabolism on the ATPase activity of muscle fibers[J]. Meat Science，2004，68（4）：587-594.

[5]Toniolo L，Maccatrozzo L，Patruno M，et al. Fiber types in canine muscles：myosin isoform expression and functional characterization[J]. American Journal of Physiology-Cell Physiology，2007，292（5）：C1915-C1926.

[6]Te Pas M F，Hulsegge I，Coster A，et al. Biochemical pathways analysis of microarray results：regulation of myogenesis in pigs[J]. BMC Developmental Biology，2007，7：66.

[7]Rescan P Y. Regulation and functions of myogenic regulatory factors in lower vertebrates[J]. Comparative Biochemistry and Physiology：Part B，2001，130（1）：1-12.

[8]Carvajal J J，Rigby P W. Regulation of gene expression in vertebrate skeletal muscle[J]. Experimental Cell Research，2010，316（18）：3014-3018.

[9]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[10]王東林，毛寶齡. 生肌調(diào)節(jié)因子及其作用機(jī)理[J]. 國外醫(yī)學(xué)：分子生物學(xué)分冊(cè)，1995，17（4）：157-160.

[11]林亞秋，張倡琿，鄭玉才，等. 九龍牦牛肌細(xì)胞生成素基因的克隆及其表達(dá)譜[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45（2）：207-211.

[12]Ye H Q，Chen S L，Xu J Y. Molecular cloning and characterization of the Myf5 gene in sea perch （Lateolabrax japonicus）[J]. Comparative Biochemistry and Physiology：Part B，2007，147（3）：452-459.

[13]Johansen K A，Overturf K. Sequence，conservation，and quantitative expression of rainbow trout Myf5[J]. Comp Biochem Physiol：Part B，2005，140：533-541.

[14]林亞秋，李瑞文，鄭玉才，等. 齊口裂腹魚和鯉魚H-FABP基因的克隆及其表達(dá)譜[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2011，27（6）：554-560.

[15]Ekmark M，Rana Z A，Stewart G，et al. De-phosphorylation of MyoD is linking nerve-evoked activity to fast myosin heavy chain expression in rodent adult skeletal muscle[J]. The Journal of Physiology，2007，584：637-650.郭志海，王鵬凱，郄紅麗，等. 楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：51-54.