張美玲　劉克鋒

摘要：以黍稷為試驗(yàn)材料，研究在不同的浸種溫度、浸種時(shí)間、水楊酸濃度對(duì)α-淀粉酶活性影響的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化設(shè)計(jì)處理試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，以確定黍稷萌發(fā)時(shí)α-淀粉酶活性最高時(shí)的參數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)的參數(shù)溫度為31.3 ℃、時(shí)間為18.44 h、水楊酸濃度為0.461 9 mmol/L，在這樣的優(yōu)化條件下，α-淀粉酶活性的理論值為0.461 9，與理論值的貼近度達(dá)97.79%。

關(guān)鍵詞：黍稷；水楊酸；浸種；NaCl脅迫；α-淀粉酶活性；響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào)： S516.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0149-04

收稿日期：2014-11-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31100509）；北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃面上項(xiàng)目 （編號(hào)：KM201210020005）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技城成果惠民科技示范工程（編號(hào)：Z121100007412003）。

作者簡(jiǎn)介：張美玲（1988—），女，山西大同人，碩士研究生，研究方向?yàn)閳@林植物栽培生理與生態(tài)。E-mail：1004990855@qq.com。

通信作者：劉克鋒，碩士，研究員，主要從事土壤肥料及花卉栽培、引種選育、工廠化標(biāo)準(zhǔn)育苗方面的研究。E-mail：liukefeng006@163.com。鹽脅迫是指植物生長(zhǎng)在濃度比較高的鹽土壤中，由于高濃度的鹽對(duì)其有很大的影響而生長(zhǎng)不良。人類賴以生存的這片大地一直受到土壤高含鹽量的困擾，中國(guó)高含鹽量土壤主要分布在黑龍江、河北、山西、西北等一些地區(qū)，近年來(lái)，設(shè)施大棚生產(chǎn)較多，同時(shí)設(shè)施內(nèi)土壤含鹽量也在逐漸增加，產(chǎn)量逐年下降，大田種植中這種情況發(fā)生也很普遍，土壤鹽漬化已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要阻礙因素之一。通過(guò)采取相應(yīng)的化學(xué)技術(shù)措施可以有效減少鹽脅迫對(duì)植物的危害，增強(qiáng)作物在高鹽度情況下也能良好生長(zhǎng)，使得作物的收獲量穩(wěn)定增加，而且每年總收獲量能呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。水楊酸（SA）是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一種簡(jiǎn)單酚類化合物，即鄰羥基苯甲酸，廣泛存在于高等植物中[1]。水楊酸浸種能夠減弱高鹽含量對(duì)黍稷的危害，使其對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性提高。黍稷是中國(guó)常見(jiàn)的種植農(nóng)作物之一，在經(jīng)歷了很長(zhǎng)的農(nóng)業(yè)種植歷史后，形成了品種種類繁多的種質(zhì)資源。黍稷屬于禾本科（Gramineae）黍?qū)僖荒晟荼局参铩１驹囼?yàn)在NaCl脅迫下，研究不同水楊酸濃度浸種對(duì)黍稷種子萌發(fā)時(shí)α-淀粉酶活性的影響，篩選合適的水楊酸濃度、浸種溫度、浸種時(shí)間，為在高鹽條件下黍稷的抗鹽栽培提供技術(shù)依據(jù)。1材料與方法

1.1材料與試劑

供試種子為黍稷原平農(nóng)20；試劑：檸檬酸緩沖液、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、高錳酸鉀、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[2]、淀粉溶液、四水硝酸鈣、硝酸鉀、硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、鐵鹽溶液（乙二胺四乙酸二鈉和七水硫酸亞鐵）、碘化鉀、硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅[3]、氯化鈷。

1.2儀器與設(shè)備

722型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），Anke TDL-40B離心機(jī)，電熱恒溫干燥箱，恒溫水浴箱。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1浸種溫度、浸種時(shí)間、水楊酸濃度確定水楊酸濃度為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol/L 5個(gè)濃度；試驗(yàn)溫度為10、20、30、40、50 ℃；時(shí)間為10、14、18、22、26 h。

1.3.2α-淀粉酶活性的測(cè)定

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[4]取試管7支，每支刻度為25 mL，各種試劑添加量見(jiàn)表1。試劑混合均勻，在沸騰的水中加熱5 min之后，取出冷卻，注入蒸餾水定容至20 mL，振動(dòng)均勻。把1號(hào)管定為CK，整到零，D540 nm波長(zhǎng)下比色。由此得出麥芽糖的方程為y=0.262 7x-0.016 8，r2=0.986 8，式中：y表示吸光度，x表示麥芽糖含量。麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

1.3.2.2α-淀粉酶的提取稱取0.5 g萌發(fā)3～5 d的黍稷種子（芽長(zhǎng)1.5～2.0 cm），放在研缽里，加少量的二氧化硅和1 mL蒸餾水，研磨至勻漿。把勻漿倒在50 mL容量瓶中，用蒸餾水將剩余物洗3次倒在容量瓶中，添加蒸餾水定容到50 mL。放在常溫下15～20 min以利于充分提取，每隔 1～2 min搖動(dòng)1次，使其完全提取。之后取少量溶液在3 000 r/min的離心機(jī)下，離心10 min，上面清澈的液體就是淀粉酶原液。

1.3.2.3α-淀粉酶活性的測(cè)定清洗試管6支，分別標(biāo)明3支為對(duì)照，3支為測(cè)定管；每個(gè)試管中加入1 mL的酶提取液，在69.5～70.5 ℃下加熱15 min，降低β-淀粉酶，拿出每支管后用自來(lái)水冷卻；各試管中加入0.1 mol/L、pH值5.6的檸檬酸提取液1 mL；對(duì)照管加入4 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，以鈍化酶的活性。再加入1%淀粉溶液2 mL，混勻；把測(cè)定管放于39.5～40.5 ℃恒溫水浴中保溫15 min后，向其中注入40 ℃下預(yù)熱的1%淀粉溶液2 mL。振動(dòng)均勻并立刻放回40 ℃水浴中保溫5 min，拿出試管后立即注入0.4 mol/L NaOH 4 mL，然后準(zhǔn)備下步糖的測(cè)定。

樣品測(cè)定：吸取上面每個(gè)試管中酶反應(yīng)之后的液體及對(duì)照管中的液體分別為2 mL，然后加入到25 mL具塞試管刻度中，再注入DNS試劑2 mL，混合均勻，放到沸騰水中加熱15 min，拿出冷卻，注入蒸餾水稀釋至20 mL，振動(dòng)均勻后，在D540 nm下對(duì)比色，記下吸光度，計(jì)算麥芽糖的量，并由以下公式計(jì)算酶活性。

結(jié)果計(jì)算：淀粉酶活性以每克鮮質(zhì)量所含麥芽糖毫克數(shù)表示[mg/（g·min）]。

α-淀粉酶=（A-A′）×Vt/（m×Vs×t ）。

式中：A表示酶水解淀粉變?yōu)樘?；A′表示淀粉酶CK管里糖含量；Vt表示樣品的稀釋液總體積；m表示樣品的鮮質(zhì)量（g）；Vs表示顯色時(shí)所用的酶液體積；t表示酶作用的時(shí)間（min）。

1.3.3響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過(guò)試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法[5-7]。

在不同的水楊酸濃度、浸種溫度、浸種時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，用Design-Expert.V8.0.6軟件[8]對(duì)其中重要的3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析（表2），進(jìn)一步優(yōu)化α-淀粉酶活性的參數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)與分析

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性用“x±s”來(lái)表示，采用Excel、SAS等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與制作圖表。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1不同浸種溫度對(duì)黍稷發(fā)芽時(shí)α-淀粉酶活性的影響設(shè)定水楊酸的濃度為1.0 mmol/L，浸種溫度為18 h，比較不同的浸種溫度（10、20、30、40、50 ℃）在含鹽量較高的土壤逆境中對(duì)黍稷長(zhǎng)芽時(shí)α-淀粉酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，α-淀粉酶的活性受浸種溫度的影響，α-淀粉酶的活性隨著浸種溫度的上升而提高，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，α-淀粉酶的活性最高，隨著浸種溫度的上升，α-淀粉酶的活性下降。因此，α-淀粉酶活性最高時(shí)浸種溫度為30 ℃。

分析結(jié)果，淀粉酶活性溫度為30 ℃顯著高于20、10、50 ℃；40 ℃顯著高于10、20 ℃；50 ℃顯著高于10 ℃，其他處理間差異不顯著。

2.1.2不同浸種時(shí)間對(duì)黍稷α-淀粉酶活性的影響設(shè)定水楊酸濃度為1.0 mmol/L，浸種溫度為30 ℃，比較不同的浸種時(shí)間（10、14、18、22、26 h）在鹽逆境條件下對(duì)黍稷α-淀粉酶的活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，α-淀粉酶的活性隨著浸種時(shí)間的延長(zhǎng)顯示出上升的趨勢(shì)，試驗(yàn)時(shí)間達(dá)18 h時(shí)為最大值，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，α-淀粉酶的活性呈下降趨勢(shì)。因此，浸種時(shí)間為18 h時(shí)α-淀粉酶活性最高。

多重比較結(jié)果：淀粉酶活性浸種18、14 h顯著高于22、10、26 h；22 h顯著于10、26 h，其他處理之間差異不顯著。

2.1.3不同水楊酸濃度對(duì)黍稷發(fā)芽時(shí)α-淀粉酶活性的影響設(shè)定浸種溫度為30 ℃，浸種時(shí)間為18 h，比較不同水楊酸濃度（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol/L）在鹽脅迫下對(duì)黍稷種子萌發(fā)的α-淀粉酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

增加也漸漸增大，當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mmol/L時(shí)，活性最大。因此，水楊酸濃度為0.5 mmol/L α-淀粉酶活性最高。

多重比較結(jié)果，淀粉酶活性當(dāng)水楊酸濃度為0.5 mmol/L顯著高于 0.25、1.00、1.25 mmol/L，其他處理間差異不顯著。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果綜合單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)α-淀粉酶的活性產(chǎn)生影響較大的水楊酸濃度、浸種溫度、浸種時(shí)間，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)并應(yīng)用軟件Design-Expert 8.0.6來(lái)分析處理數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

因素 X1（浸種溫度）、X3（水楊酸濃度）對(duì)α-淀粉酶活性的影響的線性效應(yīng) P <0.01，是極顯著，而X2（浸種時(shí)間）是顯著，X1X2、X2X3對(duì)α-淀粉酶活性的交互影響是顯著，而 X1X3不顯著，但X12、X22、 X32的曲面效應(yīng)都極顯著，說(shuō)明各個(gè)因素與響應(yīng)值之間沒(méi)有表現(xiàn)出簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，可由單因素F值的大小判斷各因素對(duì)α-淀粉酶活性的作用次序，由此得出強(qiáng)弱的次序?yàn)榻N溫度>水楊酸濃度>浸種時(shí)間。

2.2.2不同處理間的多重比較從表4可以看出：在建立的數(shù)學(xué)回歸模型中，在α=0.05水平上，X1與X2 、X2 與 X3 交互作用顯著，而 X1與X3交互作用不顯著，依據(jù)數(shù)據(jù)，作出X1X2和X2 X3的等高線圖和三維空間響應(yīng)面圖[9]，據(jù)此可分析和評(píng)價(jià)雙因素交互作用的影響（圖5、圖6）。水楊酸濃度一定時(shí)，時(shí)間與溫度的交互作用顯著，當(dāng)水楊酸濃度在零水平時(shí)，即0.5 mmol/L 時(shí)，隨著時(shí)間與溫度的增加，α-淀粉酶活性顯著增大，隨后呈下降趨勢(shì)，坡度較緩；當(dāng)溫度在零水平上時(shí)，即為30 ℃ 時(shí)，水楊酸濃度與時(shí)間的交互作用表現(xiàn)顯著，響應(yīng)值隨著水楊酸濃度與時(shí)間變大而漸漸升高，當(dāng)為最大值之后，α-淀粉酶活性反而跟著處理的增高而降低，經(jīng)軟件分析α-淀粉酶活性的最佳件：溫度31.3 ℃，時(shí)間18.44 h，水楊酸濃度0.472 5 mmol/L，在此條件下，α-淀粉酶活性的理論值為0.461 876。綜合實(shí)際操作，α-淀粉酶活性的最佳條件為：溫度30 ℃，時(shí)間18 h，水楊酸濃度0. 5 mmol/L，與理論值的貼近度達(dá)97.79%。

3結(jié)論

以黍稷為原料，從不同的溫度、時(shí)間、水楊酸濃度3個(gè)方

面考慮α-淀粉酶活性。由回歸模型方差比較結(jié)果，浸種溫度、浸種時(shí)間和水楊酸濃度對(duì)α-淀粉酶活性的影響的強(qiáng)弱順序依次為浸種溫度>水楊酸濃度>浸種時(shí)間。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)參數(shù)采用響應(yīng)面試驗(yàn)的方法處理數(shù)字，即黍稷種子萌發(fā)時(shí)α-淀粉酶活性在水楊酸濃度為0.472 5 mmol/L、溫度為31.3 ℃、時(shí)間為18.44 h的試驗(yàn)條件下，α-淀粉酶活性為0.461 9，與理論值的貼近度為97.79%。

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