范志宇　魏后軍　胡波等

摘要：本研究旨在對實驗室制備的兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗的安全性和效力進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究。實驗室制備了5批次兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗，按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄對疫苗進(jìn)行了性狀、無菌檢驗、甲醛殘留量、安全及效力試驗。結(jié)果顯示，5批次疫苗無菌檢驗、甲醛殘留量均合格；疫苗對肉兔、獺兔、毛兔3個品種家兔均安全，接種疫苗后30、60 d，剖檢注射部位未見炎癥反應(yīng)，疫苗吸收良好，并且疫苗對懷孕母兔、未斷奶仔兔、斷奶幼兔也安全；對肉兔各項生產(chǎn)性能也沒有影響，說明該疫苗具有較好的安全性。疫苗免疫21 d后，易感家兔和母兔均能抵抗兔出血癥強(qiáng)毒攻擊，說明該疫苗免疫原性良好。

關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒桿狀病毒；滅活疫苗；安全性試驗；效力試驗

中圖分類號： S852.65；S858.291.53文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0272-03

收稿日期：2015-07-02

基金資助：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)兔體系病毒病預(yù)防與控制崗位（編號：CARS-44-C-1）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（編號：201303046）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（14）4048]。

作者簡介：范志宇（1982—），男，山西太谷人，博士，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。Tel：（025）84390337；E-mail：fanzhiyu2007@163.com。

通信作者：王芳，博士，研究員，主要從事家兔重要疫病的病原學(xué)、快速診斷、流行病學(xué)、致病機(jī)理、疫苗研制、綜合防控技術(shù)等方面的研究。Tel：（025）84390337；E-mail：rwangfang@126.com。兔出血癥，又稱兔瘟，是由兔出血癥病毒（rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一種以急性、高度傳染性、大面積死亡為特征的兔傳染病，主要臨床特征為呼吸系統(tǒng)出血、肝變性、實質(zhì)器官瘀血及出血性變化[1-3]。本病常呈暴發(fā)性流行，發(fā)病率和病死率極高，感染兔通常于48～72 h死亡，給養(yǎng)兔業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。該病自然感染只發(fā)生于兔，主要危害40日齡以上幼兔、育成兔和成年兔，40日齡以下幼兔和部分老齡兔不易感，哺乳仔兔不發(fā)病[2-4]。帶毒兔及病死兔的內(nèi)臟器官、肌肉、毛、血液、分泌物、排泄物是主要的傳染源，帶毒兔和被病毒污染的飼料、飲水、用具也是重要的傳染源或傳播媒介。目前該病的主要預(yù)防措施是使用組織滅活疫苗免疫，然而傳統(tǒng)組織滅活苗的制備存在諸多的缺陷和不足，因此，需要探索新的生產(chǎn)疫苗的途徑[5-6]。

RHDV是杯狀病毒科成員，結(jié)構(gòu)簡單，僅有1個主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60，在誘導(dǎo)抗病毒感染的免疫反應(yīng)中起重要作用，是病毒免疫保護(hù)性抗原，用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)RHDV的VP60能夠自發(fā)地組裝成病毒樣粒子（VLPs），其在形態(tài)和抗原性上都與天然的病毒粒子無異但不包含病毒RNA基因組。研究發(fā)現(xiàn)RHDV VLPs在兔體內(nèi)可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答和黏膜免疫應(yīng)答。此外，RHDV VLPs具有成本低、獲取方便等優(yōu)勢，已經(jīng)成為應(yīng)用性預(yù)防治療中可靠的分子工具[3-7]。在前期研究的基礎(chǔ)上，于實驗室用RHDV重組VP60制備了5批次疫苗，并對疫苗開展了系統(tǒng)的研究。

1材料與方法

1.1種毒

重組兔出血癥病毒VP60桿狀病毒，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所構(gòu)建并保存[5]。攻毒用毒種為兔出血癥病毒皖阜株肝毒。Sf9昆蟲細(xì)胞，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.2試驗兔

2～3月齡健康易感肉兔、獺兔、毛兔（兔出血癥病毒抗體HI效價不高于1 ∶2），健康懷孕20～25 d母兔，20～30日齡未斷奶仔兔、35日齡已斷奶幼兔（未免疫兔出血癥及相關(guān)疫苗），均由金陵種兔場提供。

1.3試劑

Sf-900TMⅡSFM 培養(yǎng)基，購自GIBCO公司。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG）、酪胨瓊脂（GA）、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（GP）、氫氧化鋁膠溶液由南京天邦生物科技有限公司制備并檢驗。

1.4抗原制備及紅細(xì)胞凝集效價的測定

將重組兔出血癥病毒VP60桿狀病毒接種Sf9昆蟲細(xì)胞，于27～28 ℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察，待細(xì)胞病變達(dá)85%以上時，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。將收獲接種種毒的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，取50 μL于50孔板，用PBS作2倍比稀釋，加入等體積1%人O型紅細(xì)胞懸液，振蕩均勻，置于2～8 ℃作用45 min，觀察結(jié)果，檢測表達(dá)蛋白的HA效價[8-9]。

1.5滅活及滅活檢驗[9]

向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入甲醛溶液（終濃度為0.2%），37 ℃滅活24 h。取滅活細(xì)胞培養(yǎng)物，接種生長良好的Sf9細(xì)胞，于27～28 ℃條件下培養(yǎng)，同時設(shè)立未滅活的細(xì)胞培養(yǎng)物為陽性對照，按上述方法接種Sf9細(xì)胞，連續(xù)5 d觀察細(xì)胞病變，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，置-20 ℃以下反復(fù)凍融3次，接種生長良好的Sf9細(xì)胞盲傳1代，培養(yǎng)5 d，觀察細(xì)胞病變，并測定其血凝性。

1.6疫苗制備

將檢驗合格的細(xì)胞培養(yǎng)物和氫氧化鋁膠按9 ∶1充分混勻振蕩，定量分裝，加蓋密封，貼簽。

1.7成品檢驗

1.7.1性狀取疫苗瓶上下顛倒混勻，觀察外觀及顏色，然后將疫苗瓶于2～8 ℃靜置24 h，再次觀察外觀及顏色。

1.7.2無菌檢驗按2010版《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗。

1.7.3甲醛殘留量測定按2010版《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗。

1.8安全試驗[10]

1.8.1單劑量安全試驗

1.8.1.1單劑量安全試驗實驗室制備的5批次疫苗（批號：101、102、103、104、105）各用2～3月齡健康易感家兔5只，分別皮下注射1 mL/只，同時以相同條件家兔作為對照，不接種疫苗，觀察家兔精神狀態(tài)、飲食、糞便、局部及全身反應(yīng)等，連續(xù)觀察14 d。

1.8.1.2單劑量重復(fù)安全試驗5批次疫苗各用2～3月齡健康易感家兔5只，分別皮下注射1 mL/只，14 d后，重復(fù)皮下注射相同劑量的滅活疫苗，以相同條件家兔作為對照，不接種疫苗，觀察家兔精神狀態(tài)、飲食、糞便、局部及全身反應(yīng)等，連續(xù)觀察14 d。

1.8.2超劑量安全試驗

1.8.2.1不同品種家兔安全試驗實驗室制備的5批次疫苗各用2～3月齡健康易感肉兔、獺兔、毛兔各5只，分別皮下注射2 mL/只，同時以相同條件家兔作為對照，不接種疫苗，觀察家兔精神狀態(tài)、飲食、糞便、局部及全身反應(yīng)等，連續(xù)觀察60 d，并于30 d每組取2只、60 d每組取3只安樂死后進(jìn)行剖檢，觀察疫苗注射部位局部組織疫苗吸收和炎癥反應(yīng)情況。

1.8.2.2懷孕母兔安全試驗5批次疫苗各用懷孕20～25 d 母兔5只，分別皮下注射2 mL/只，以相同條件不接種疫苗家兔作為對照，觀察精神狀態(tài)、飲食、糞便、局部及全身反應(yīng)等，并觀察懷孕母兔妊娠、分娩及胎兒健康狀況，觀察期14 d。

1.8.2.3其他日齡家兔安全試驗5批次疫苗各用35日齡斷奶未免疫兔出血癥疫苗的幼兔5只，并各用20～30日齡未斷奶未免疫兔出血癥疫苗的仔兔5只進(jìn)行安全試驗，處理方法同“1.8.2.2”節(jié)。

1.8.2.4對肉兔生產(chǎn)性能的影響5批次疫苗各用35～40日齡的健康肉兔5只，分別皮下注射2 mL/只，以相同條件家兔作為對照，不接種疫苗，每日10：00測量并記錄 14 d 內(nèi)家兔的體溫，觀察45 d內(nèi)家兔生長發(fā)育情況，記錄注射疫苗時和觀察期結(jié)束時家兔的體質(zhì)量，觀察期內(nèi)飼料消耗的重量，觀察期結(jié)束時出欄家兔數(shù)量，并計算家兔增重、飼料報酬（料肉比）、出欄率等。

1.9效力試驗

1.9.1易感家兔效力試驗實驗室制備的5批次疫苗各用2～3月齡健康易感家兔5只，分別皮下注射1 mL/只，21 d后，連同相同條件對照兔5只，各皮下注射兔出血癥病毒皖阜株肝毒1 mL，連續(xù)觀察7 d，記錄死亡與保護(hù)的動物數(shù)量，對死亡兔剖檢觀察并取肝臟進(jìn)行人“O”型紅細(xì)胞凝集試驗。

1.9.2懷孕母兔效力試驗實驗室制備的5批次疫苗各用健康懷孕母兔5只，處理方法同“1.9.1”節(jié)。

2結(jié)果與分析

2.1抗原紅細(xì)胞凝集效價

經(jīng)測定，5批次細(xì)胞培養(yǎng)物紅細(xì)胞凝集效價在1 ∶512～1 ∶1 024 之間，分別為1 ∶1 024、1 ∶512、1 ∶512、1 ∶1 024、1 ∶512。

2.2滅活檢驗

用甲醛溶液對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行滅活，結(jié)果顯示，接種滅活細(xì)胞培養(yǎng)物的Sf9昆蟲細(xì)胞及正常Sf9昆蟲細(xì)胞生長狀況良好，細(xì)胞分裂正常。收獲接毒細(xì)胞培養(yǎng)物，于-20 ℃以下反復(fù)凍融3次，取適量再次接種生長良好的Sf9細(xì)胞，于27～28 ℃ 培養(yǎng)5 d，結(jié)果顯示，接種滅活細(xì)胞培養(yǎng)物的Sf9昆蟲細(xì)胞及正常Sf9昆蟲細(xì)胞生長狀況良好，細(xì)胞分裂正常；而加入未滅活細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞病變明顯，細(xì)胞培養(yǎng)物具有血凝性。說明接毒細(xì)胞培養(yǎng)物滅活完全。

2.3疫苗配制

按“1.6”節(jié)的方法制備試驗用疫苗5批次，約4 000 mL/批次，批號為101、102、103、104、105。

2.4性狀、無菌檢驗、甲醛殘留量測定

對5批次疫苗進(jìn)行性狀、無菌檢驗、甲醛殘留量測定，結(jié)果顯示，5批次疫苗（101、102、103、104、105）外觀為淺黃色均勻混懸液，靜置后上層為淺黃色的澄清液體，下層有少量沉淀。TG小管、GA斜面在37 ℃培養(yǎng)7 d，TG小管、GA斜面、GP小管在25 ℃培養(yǎng)7 d均無菌生長，無菌檢驗合格。經(jīng)檢驗，疫苗甲醛殘留量在0.042%～0.087%之間，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.5安全試驗

2.5.1單劑量安全試驗用5批次疫苗對家兔進(jìn)行單劑量安全試驗，連續(xù)觀察14 d，結(jié)果顯示，免疫兔和對照兔的精神狀態(tài)、飲食、糞便等均正常，免疫兔未見疫苗接種引起的異常臨床癥狀，說明疫苗對2～3月齡健康易感家兔單劑量接種及單劑量重復(fù)接種均是安全的。

2.5.2超劑量安全試驗

2.5.2.1不同品種家兔安全試驗用5批次疫苗進(jìn)行不同品種家兔安全試驗，結(jié)果顯示，觀察期60 d，2～3月齡肉兔、獺兔、毛兔3個品種家兔的精神狀態(tài)、飲食、糞便等均正常；免疫兔未見疫苗接種引起的異常臨床癥狀，疫苗接種后30 d及60 d，剖檢注射部位未見炎癥反應(yīng)，疫苗吸收良好，說明疫苗對不同品種的家兔是安全的。

2.5.2.2懷孕母兔安全試驗用5批次疫苗進(jìn)行懷孕母兔安全試驗，結(jié)果顯示，觀察期14 d，免疫兔和對照兔的精神狀態(tài)、飲食、糞便等均正常；免疫兔未見疫苗接種引起的異常臨床癥狀，母兔均正常妊娠、分娩，免疫兔和對照兔生產(chǎn)的仔兔數(shù)量沒有差異，胎兒健康，未見異常，說明疫苗對懷孕母兔是安全的。

2.5.2.3其他日齡家兔安全試驗用5批次疫苗對其他日齡家兔進(jìn)行安全試驗，結(jié)果顯示，觀察期14 d，未斷奶仔兔、已斷奶幼兔的免疫兔和對照兔精神狀態(tài)、飲食、糞便等均正常，仔兔正常斷奶，并且生長良好；免疫兔未見疫苗接種引起的異常臨床癥狀，說明該疫苗對未斷奶仔兔和已斷奶幼兔均是安全的。

2.5.2.4對肉兔生產(chǎn)性能的影響用5批次疫苗進(jìn)行肉兔生產(chǎn)性能影響試驗，結(jié)果顯示，觀察期14 d，免疫兔和對照兔體溫處于38.5～39.5 ℃的正常范圍內(nèi)，免疫兔與對照兔相比較，體溫沒有明顯差異（圖1）。觀察期45 d，免疫兔和對照兔生長發(fā)育均良好，免疫組各5只家兔共增加體質(zhì)量分別為6 207、6 367、6 314、5 960、6 068 g，對照組5只家兔共增加體質(zhì)量6 108 g，由此計算飼料報酬（料肉比），免疫組與對照組相比較，差異不顯著（P>0.05）；出欄率均為100%（表1）。結(jié)果說明該疫苗對肉兔生產(chǎn)性能沒有影響。

2.6效力試驗

用5批次疫苗進(jìn)行效力試驗，結(jié)果（表2）顯示，5批疫苗免疫易感家兔全部健康存活，對照兔死亡5只，死亡兔出現(xiàn)兔出血癥典型的病理變化，對死亡兔肝臟懸液作人“O”型紅細(xì)胞凝集試驗，均為RHDV陽性。另一組攻毒結(jié)果顯示，5批疫苗免疫母兔全部健康存活，對照兔死亡4只，死亡兔出現(xiàn)兔出血癥典型的病理變化，對死亡兔肝臟懸液作人“O”型紅細(xì)胞凝集試驗，均為陽性。結(jié)果說明該疫苗可以對母兔和易感家兔提供完全保護(hù)。

3討論

目前，由于兔出血癥病毒不能在兔體以外的組織或細(xì)胞上增殖，因此，只能通過用強(qiáng)毒接種易感兔，收獲含毒組織制成乳劑，用甲醛滅活后制成疫苗[6，11]。這種生產(chǎn)方式主要存在以下缺陷和不足：易感兔來源少、生產(chǎn)成本高、污染物安全處理困難且易造成散毒、動物福利難以保障等。利用基因工程技術(shù)開發(fā)新疫苗是解決當(dāng)前傳統(tǒng)疫苗問題的有效途徑，國內(nèi)外已經(jīng)用大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞等多種表達(dá)系統(tǒng)對RHDV的免疫蛋白VP60進(jìn)行了表達(dá)，并且多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)都表現(xiàn)出良好的免疫原性[3，12]。桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的RHDV重組衣殼蛋白能夠很好地自聚形成能夠凝集人“O”型紅細(xì)胞的病毒樣顆粒（VLPs），由于VLPs結(jié)構(gòu)與成熟病毒相似，但不含病毒核酸，不具有感染性，所以在體內(nèi)這種空殼結(jié)構(gòu)VLPs不會引發(fā)感染，因此作為疫苗非常安全[13]。而且VLPs能夠在很低劑量的抗體情況下引發(fā)有效的保護(hù)性反應(yīng)，這將大大降低疫苗的成本，同時該表達(dá)系統(tǒng)具有低成本、高表達(dá)和易于規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)[14，15]。

本研究在完成重組兔出血癥病毒VP60桿狀病毒毒種的構(gòu)建及特性研究的基礎(chǔ)上，實驗室試制了5批次疫苗（批號101、102、103、104、105），共計約20 000 mL。按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄對5批次疫苗進(jìn)行性狀、無菌、甲醛殘留量檢驗及安全、效力試驗，結(jié)果顯示，5批次疫苗無菌檢驗、甲醛殘留量均合格。安全性結(jié)果表明，該疫苗可以用于懷孕母兔，優(yōu)于目前市售組織滅活疫苗，并且對20～30日齡未斷奶仔兔、35日齡已斷奶幼兔都非常安全，對肉兔的各項生產(chǎn)性能也沒有影響。本研究的安全性試驗是使用5批次疫苗免疫3個品種家兔的多次試驗完成的，試驗結(jié)果說明該疫苗對各個年齡段的家兔均是安全的。疫苗免疫21 d后2～3月齡家兔和母兔用致死劑量的兔出血癥病毒攻擊保護(hù)率都達(dá)100%，說明該疫苗免疫原性良好。該疫苗具有較高的安全性和良好的免疫原性，市場前景樂觀。

參考文獻(xiàn)：

[1]陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：457-458.

[2]谷子林，秦應(yīng)和，任克良. 中國養(yǎng)兔學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：509-511.

[3]Abrantes J，van der Loo W，le Pendu J A. Rabbit haemorrhagic disease （RHD） and rabbit haemorrhagic disease virus （RHDV）：a review[J]. Veterinary Research，2012，43：12-21.

[4]Marques R M，Teixeira L，guas A P，et al. Immunosuppression abrogates resistance of young rabbits to Rabbit Haemorrhagic Disease（RHD）[J]. Veterinary Research，2014，45（1）：1-6.

[5]王芳，胡波，任雪楓，等. 兔出血癥病毒衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及對家兔的免疫保護(hù)效果[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（10）：1382-1387.

[6]Huang H B. Vaccination against and immune response to viral haemorrhagic disease of rabbits：a review of research in the Peoples Republic of China[J]. Revue Scientifique et Technique，1991，10（2）：481-498.

[7]Marín M S，Martín A J ，Pérez O G L，et al. Immunogenic properties of rabbit haemorrhagic disease virus structural protein VP60 expressed by a recombinant baculovirus：an efficient vaccine[J]. Virus Research，1995，39（2/3）：119-128.

[8]王啟明，董亞芳. NY/T572—2002兔出血病血凝和血凝抑制試驗方法[S].

[9]中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典：三部[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[10]唐應(yīng)華，陸吉虎，吳培培，等. 免疫增強(qiáng)劑對禽流感疫苗免疫持續(xù)期、安全性和雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，30（4）：821-825.

[11]寧宜寶.獸用疫苗學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008：390-391.

[12]Mikschofsky H，Schirrmeier H，Keil G M，et al. Pea-derived vaccines demonstrate high immunogenicity and protection in rabbits against rabbit haemorrhagic disease virus[J]. Plant Biotechnology Journal，2009，7（6）：537-549.

[13]Ludwig C，Wagner R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes[J]. Current Opinion in Biotechnology，2007，18（6）：537-545.

[14]Perez-Filgueira D M，Resino-Talavan P，Cubillos C，et al. Development of a low-cost，insect larvae-derived recombinant subunit vaccine against RHDV[J]. Virology，2007，364（2）：422-430.

[15]Fernández E，Toledo J R，Chiong M，et al. Single dose adenovirus vectored vaccine induces a potent and long-lasting immune response against rabbit hemorrhagic disease virus after parenteral or mucosal administration[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，2011，142（3/4）：179-188.董亞青，朱文斗，王琳琳，等. 雞α-干擾素在畢赤酵母中的表達(dá)及其表達(dá)條件優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11

：275-277.