中國蜂膠膠源植物研究

王雪++羅照明++張紅城等

摘要：蜂膠的主要成分是樹脂，因此樹脂來源決定了蜂膠的理化性質(zhì)，最終影響蜂膠功效。采集了楊屬植物中毛白楊、鉆天楊、河北楊、小葉楊、加拿大楊、青楊、歐洲黑楊、中華紅葉楊、大青楊、響葉楊等10種楊樹的樹芽，松科植物中白皮松、華山松、美人松、油松、雪松分泌的樹脂，另外還有來自楊柳、樺樹的樹芽，通過HPLC-DAD方法對(duì)以上各種樹脂進(jìn)行分析，將得到的液相圖譜與中國蜂膠的指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)中國蜂膠的指紋圖譜與楊屬黑楊派中歐洲黑楊與美洲黑楊的雜交品種——加拿大楊的樹芽分泌物（即芽脂），無論在多酚類化合物種類還是各成分含量上都非常相似。因此，中國蜂膠的膠源植物是歐洲黑楊及其雜交品種——加拿大楊。

關(guān)鍵詞：蜂膠；樹脂；膠源植物；加拿大楊

中圖分類號(hào)： S896.6；S897文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0385-07

收稿日期：2014-12-09

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2011BAD33B04）。

作者簡(jiǎn)介：王雪（1989—），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：917688016@qq.com。

通信作者：張根生，碩士，教授，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：zhgsheng@163.com。蜂膠是工蜂采集植物幼芽或其他組織部位分泌的樹膠，并混入蜂蠟、花粉和自身分泌物等物質(zhì)而得到的一種具有特殊芬芳味的黏性物質(zhì)[1]。蜂膠化學(xué)成分復(fù)雜，其中大部分成分來自樹脂，不同植物來源的樹脂會(huì)使其化學(xué)成分有所差異，并最終影響其功效[1-3]。目前可用3種方法鑒定蜂膠的植物來源，分別是蜜蜂行為學(xué)觀察、膠源植物碎片形態(tài)學(xué)觀察、蜂膠與植物化學(xué)組分比較。已知的蜂膠膠源植物有楊屬、酒神菊屬、樺木屬、黃檀屬、柏科、克魯西亞屬、血桐屬等，不同植物來源的蜂膠存在一定地域差異[4-5]。楊樹型蜂膠主要來自歐洲、北美洲、亞洲、大洋洲等地，膠源植物是歐洲黑楊[6-7]；巴西綠蜂膠的膠源植物是酒神菊屬植物[8]；俄羅斯的蜂膠是樺樹型[9]；古巴、巴西、墨西哥的紅蜂膠膠源植物是黃檀屬植物[10]；來自希臘和意大利的蜂膠屬于地中海型，膠原植物是柏科[11]；古巴和委內(nèi)瑞拉地區(qū)的蜂膠屬于克魯西亞型，膠源植物是書帶木屬（Clusia）植物[12-13]；太平洋區(qū)域的蜂膠則來自于血桐屬植物[14-15]。中國地域廣闊，植物種類繁多，因而中國蜂膠成分復(fù)雜，蜂膠植物來源多樣。目前一般認(rèn)為中國蜂膠的植物來源是楊屬植物，也有研究者提出松樹、柳樹、樺樹等植物也可能是蜂膠來源[16-17]。然而目前缺少對(duì)中國蜂膠膠源植物的系統(tǒng)研究，例如中國蜂膠是采自單一植物還是幾種植物、采自不同省份蜂膠的膠源植物是否存在差異，這些問題尚沒有定論。本研究采用高效液相色譜-二極管陳列檢測(cè)器（HPLC-DAD）方法，從化學(xué)組分上分析中國蜂膠和植物樹脂的差異，旨在找出中國蜂膠的膠源植物。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品5種楊樹芽采自北京植物園內(nèi)加拿大楊（Populus canadensis Moench）、鉆天楊（Populus nigra varitalica）、毛白楊 （Populus tomentosa Carr）、河北楊（Populus hopeiensis Huet Chow）、小葉楊（Populus simonii Carr），另外3種楊樹芽采自江蘇省泗陽縣楊樹博物館內(nèi)歐洲黑楊（Populus nigra L.）、青楊（Populus cathayana）、中華紅葉楊（Populus deftadides），而大青楊（Populus ussuriensis）、響葉楊（Populus adenopoda Maxim）的楊樹芽來自伊春小興安嶺植物園。5種松樹樹脂采自北京植物園內(nèi)白皮松（Pinus bungeana Zucc）、華山松（Pinus armandii Franch）、美人松（Pinus sylvestris var. sylvestriformis）、油松（Pinus tabulaeformis Carr）、雪松（Cedrus）。柳樹芽、樺樹芽采自北京植物園垂柳（Salix babylonica L.）、樺樹（Betula）。

1.1.2試劑3，4-二羥基苯甲醛、香草酸、 咖啡酸、香蘭素、p-香豆酸、阿魏酸、異阿魏酸、苯甲酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、咖啡酸苯乙酯、肉桂酸肉桂酯、短葉松素、槲皮素、山姜素、山奈酚、芹菜素、異鼠李素、松屬素、柯因、高良姜素來自Sigma公司；亞桂皮乙酸、咖啡酸卞酯來自Funakoshi公司；短葉松素-3-乙酸酯、球松素、柚木柯因來自BioBioPha公司；p-香豆酸卞酯、5-甲氧基短葉松素是筆者所在實(shí)驗(yàn)室從蜂膠中收集獲得的。

1.1.3主要儀器與設(shè)備Milli-Q Intergral純水/超純水一體化系統(tǒng)，美國Merk Millipore公司；AL204型分析天平，梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5 型低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；微量移液器，德國Eppendorf公司；HZS-H型水浴搖床，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；LC-6AD高效液相色譜儀[配有二極管陣列紫外檢測(cè)器（PDA）、SIL-自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10A柱溫箱、LCsolution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)]，日本島津公司。

1.2方法

1.2.1植物樹脂的處理稱取0.5 g各種楊樹芽及松樹樹脂、柳樹芽、樺樹芽于10 mL容量瓶中，用75%乙醇溶液定容到10 mL。超聲3 h，功率100 W，溫度25 ℃。超聲后，在40 ℃、100 r/min水浴搖床中提取12 h。離心收集提取液，0.22 μm微孔膜過濾，待用；上樣前稀釋6倍。

1.2.2加拿大楊芽脂的處理采集加拿大楊的樹芽，用鑷子把分泌在芽表面的紅色芽脂剝下收集，即為加拿大楊芽脂。按照“1.2.1”節(jié)中的方法提取芽脂。

1.2.3HPLC色譜條件HPLC條件：Shim-Pack PREP-ODS （250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；柱溫箱溫度35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：B相為甲醇（0.1%乙酸），A相為水（0.1%乙酸），梯度洗脫程序如下：0 ～25 min，22%～36%B；25 ～55 min，36%～52%B；55 ～90 min，52%～63%B；90 ～115 min，63%～70%B；115 ～135 min，70%～75%B；135 ～150 min，75%～80%B；流速為 1 mL/min。

2結(jié)果與分析

2.1中國蜂膠醇提物的HPLC指紋圖譜

蜂膠含有約55%樹脂、30%蜂蠟、10%揮發(fā)性油、5%花粉等[1]。蜂膠中超過一半的成分是樹脂，所以其成分差異主要是由不同植物來源的樹脂造成的。樹脂是由植物特定組織合成分泌、具有重要生理活性的一類物質(zhì)，包含揮發(fā)、非揮發(fā)2大部分，有萜烯類和酚類2種類型[18]。萜烯類樹脂中的揮發(fā)性成分較多，主要是單萜、倍半萜；不揮發(fā)成分是二萜、三萜及其聚合物。萜烯類樹脂一般由松柏科植物分泌，但也廣泛分布在被子植物中。酚類樹脂中的非揮發(fā)性成分占主導(dǎo)地位，主要是黃酮類，揮發(fā)性成分是酚酸和酯類，常出現(xiàn)于被子植物中，且與萜烯類物質(zhì)一起分泌在植物幼嫩的部位上[18]。

本研究采用的中國蜂膠指紋圖譜來自筆者所在實(shí)驗(yàn)室前人的研究結(jié)果[19]。在全國25個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)）采集了105個(gè)蜂膠毛膠樣品，通過HPLC-DAD方法得到每個(gè)樣品的紫外圖譜，運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算得到中國蜂膠的指紋圖譜（圖1-A），標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見圖1-B。試驗(yàn)結(jié)果表明，中國蜂膠的化學(xué)成分主要是咖啡酸、p-香豆酸、3，4-二甲氧基肉桂酸等酚酸及相應(yīng)的酯類和短葉松素、松屬素、柯因、高良姜素等黃酮類物質(zhì)[19]。這些成分與酚類樹脂中的化學(xué)成分相似，因此中國蜂膠的膠源植物應(yīng)該是富含酚類樹脂的植物，而不是分泌萜烯類樹脂的植物。

2.2各種植物樹脂的HPLC圖譜

2.2.1松樹樹脂、楊柳芽、樺樹芽醇提物的HPLC圖譜由圖2可見，保留時(shí)間短的是酚酸類等極性大的物質(zhì)，保留時(shí)間長(zhǎng)的是黃酮和一些酯類物質(zhì)。由圖1、圖2可見，松樹樹脂的醇溶性成分少，而蜂膠醇提物中富含大量的酚酸、黃酮，二者差別很大。除雪松外，另4種松樹樹脂醇提物HPLC圖譜中

前3個(gè)較大的峰都相似，說明它們是3種相同的酚酸類物質(zhì)；通過比較蜂膠中酚酸類物質(zhì)的保留時(shí)間和DAD紫外光譜圖，表明蜂膠中并不具有這3種酚酸類物質(zhì)。白皮松和雪松樹脂中黃酮及酯類成分較多，但與蜂膠中的成分并不一樣。運(yùn)用圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件得出，各種松樹樹膠與蜂膠醇提物的相似度均低于0.1，進(jìn)一步說明中國蜂膠與松樹樹脂的成分相差大。此外，松屬植物的樹脂屬于萜烯類[18]，而中國蜂膠的化學(xué)組分與酚類樹脂相似。因此，中國蜂膠的植物來源并不是松屬植物。

另外，垂柳芽醇提物中的酚酸類成分較多，基本不含黃酮；而樺樹芽中同時(shí)含有酚酸和黃酮，但明顯與蜂膠中各物質(zhì)的保留時(shí)間不同。運(yùn)用圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件得出，中國蜂膠與楊柳、樺樹的相似度也都低于0.1。有人認(rèn)為中國蜂膠可能來自柳樹、樺樹的樹脂[19]，通過本試驗(yàn)結(jié)果（圖2）可知，柳樹和樺樹的樹脂成分與中國蜂膠存在差異，說明它們并不是中國蜂膠的膠源植物。

2.2.2楊樹芽醇提物HPLC圖譜楊樹是楊柳科楊屬植物落葉喬木的統(tǒng)稱，是世界上廣泛栽培的重要造林樹種之一[20]。楊樹種類非常多，分為黑楊派、白楊派、青楊派、胡楊派、大葉楊派[21]。楊樹嫩芽中富含酚類樹脂，為次級(jí)代謝產(chǎn)物，可保護(hù)嫩芽免受蟲害和惡劣氣候的傷害[22]。我國楊樹資源豐富，現(xiàn)已成為世界上楊樹人工林面積最大的國家，在 20°～54°N、80°～134°E，海拔3 800m以下的地區(qū)均有楊樹生長(zhǎng)[23]。如圖3所示，楊屬中9種楊樹芽的酚酸和黃酮種類都相對(duì)較多。它們雖然同屬于楊屬，但是不同種間的樹芽醇提物具有很大差異。中華紅葉楊屬于黑楊派中人工培育的雜交品種，其芽中多酚類物質(zhì)比較齊全，與蜂膠的指紋圖譜相似度高達(dá)0.812。這可能是由于中華紅葉楊樹芽醇提物中有3個(gè)大峰與蜂膠中的接近，對(duì)相似度貢獻(xiàn)度大造成的，實(shí)際上蜂膠與中華紅葉楊芽脂的化學(xué)成分還是有一定差異。同屬于黑楊派的鉆天楊、歐洲黑楊、響葉楊，與蜂膠的相似度分別為 0.518、0.595、0.706，其酚酸類物質(zhì)較多。屬于白楊派的毛白楊和屬于青楊派的青楊、大青楊中的黃酮及酯類物質(zhì)多，它們與蜂膠的相似度分別是0.201、0.569、0.737。在保留時(shí)間 90 min 以前，白楊派的雜交品種——河北楊的酚類物質(zhì)很多，其與蜂膠的相似度為0.326。屬于青楊派的小葉楊中酚類物質(zhì)很少，與蜂膠的相似度僅為0.097。綜上，雖然這幾種楊樹芽醇提物與中國蜂膠的指紋圖譜有一定差異，但與松樹樹脂、楊柳芽及樺樹芽的醇提物相比，相似度都更高。其中黑楊派和青楊派中的響葉楊和大青楊的樹芽醇提物與蜂膠指紋圖譜最為接近，說明中國蜂膠很可能來自楊屬黑楊派或青楊派中楊樹的樹芽。

圖4是黑楊派中加拿大楊（以下簡(jiǎn)稱加楊）樹芽乙醇提取物及樹芽芽脂的HPLC色譜圖。圖5為加楊樹芽和樹芽分泌的芽脂，在加楊樹芽表面發(fā)現(xiàn)有一種紅色的樹脂分泌出來，即加楊芽脂，它具有和蜂膠相似的芬香氣味及黏性。從圖4可見，黑楊派的雜交品種——加楊芽脂與蜂膠的指紋圖譜（圖1-a）最相近，無論在物質(zhì)種類上，還是各物質(zhì)含量上都很相近，相似度高達(dá)0.814；而樹芽醇提取物組分與蜂膠在成分種類和含量上也基本相似，相似度為0.724。這個(gè)差異可能是在人工提取楊樹芽樹脂的過程中，破壞了芽的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其他非芽脂成分流出，而在自然條件下的楊樹芽脂中是不存在這個(gè)物質(zhì)的。蜜蜂在采集蜂膠時(shí)也是采集楊樹芽表面分泌的樹脂，而不會(huì)破壞楊樹芽上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。因此，蜂膠和加楊的芽脂成分最為一致。

2.3各種楊樹芽醇提物中多酚類成分的定量

通過標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)以上10種楊樹的芽及加楊芽脂的醇提物成分進(jìn)行定量分析。由表1可以看出，不同種類楊樹芽醇提物在多酚類成分種類及含量上有很大差異，其中鉆天楊、加楊、歐洲黑楊的多酚種類較多，含量也較高；而毛白楊、中華紅葉楊、響葉楊的多酚種類少，毛白楊、中華紅葉楊的多酚含量低?？傮w而言，楊樹芽醇提物總黃酮含量較高，尤其是響葉楊、大青楊。楊樹芽加楊芽脂的種類最豐富，總酚酸、總黃酮含量分別為135.98、153.92 mg/g，也是所有楊樹芽醇提物中最高的，與蜂膠成分最接近。從組成成分上也可以看出，加楊芽脂是一種酚類樹脂，也與中國蜂膠的成分吻合。

許多研究認(rèn)為，溫帶地區(qū)蜂膠的植物來源是歐洲黑楊[19]。我國歐洲黑楊很少，僅在阿爾泰地區(qū)有天然林分布[21]。加拿大楊是歐洲黑楊和美洲黑楊的雜交品種，原產(chǎn)于美洲，19世紀(jì)中葉引入我國。我國采集蜂膠的蜂種主要是20世紀(jì)初引入的意大利蜜蜂（以下簡(jiǎn)稱意蜂），其起源于歐洲，主要以歐洲黑楊作為膠源植物。近代引入我國的意蜂，可能還沒有適應(yīng)采集我國本土楊樹品種的樹脂，如毛白楊、鉆天楊等，只能采集歐洲黑楊及其雜交品種——加拿大楊的樹脂。此外，加楊生長(zhǎng)范圍廣[20]，除廣東、云南、西藏等地外，各?。▍^(qū)）均有引種栽培，這就為意蜂提供了充足的樹脂來源?？傊?，由于歐洲黑楊在我國分布很少，意蜂引入我國后，可能自然選擇了歐洲黑楊的雜交品種——加拿大楊作為其蜂膠的植物來源。

世界范圍內(nèi)的蜂膠具有多種植物來源。中國植物種類繁多，除楊屬外，還生長(zhǎng)著其他種類的膠源植物。因此有人認(rèn)為中國蜂膠來源于多種膠源植物，筆者認(rèn)為不存在這種情況。首先中國蜂膠的所有成分基本能和加楊芽脂的成分一一對(duì)應(yīng)，含量比例也一致；其次，雖然采集到的某些樹脂中個(gè)別成分與蜂膠的一些成分一致，但是這些成分是隨機(jī)出現(xiàn)的，并且零星分布在樹脂中[18]，并不能說明蜂膠來自這些樹脂，只有與蜂膠成分完全對(duì)應(yīng)才行；再次，假如中國蜂膠來源于多種植物，那么全國范圍內(nèi)不可能每一處都同時(shí)生長(zhǎng)著加楊和其他膠源植物，肯定存在一些地區(qū)蜜蜂只能采集其他膠源植物的樹脂，但在本研究收集的樣品中并沒有發(fā)現(xiàn)化學(xué)成分與加楊表1各種楊樹芽醇提物中多酚類化合物含量芽脂存在很大差異的蜂膠[19]；最后，市場(chǎng)上蜂膠產(chǎn)品的原料來源比本研究收集的樣品更廣泛，具有非常大的代表性，筆者在分析北京地區(qū)市售的18個(gè)品牌蜂膠產(chǎn)品成分時(shí)，發(fā)現(xiàn)蜂膠產(chǎn)品的成分與加楊芽脂成分一致[24]，并不存在其他膠源植物樹脂的特征成分。因此本研究認(rèn)為，中國蜂膠的膠源植物是來自歐洲的黑楊及其雜交品種加拿大楊。

3結(jié)論

本研究將松屬植物、垂柳、樺樹及不同楊樹樹脂的醇提物高效液相圖譜與中國蜂膠指紋圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)中國蜂膠的化學(xué)成分無論在種類還是相對(duì)含量上都與加拿大楊樹的芽脂相似，因此認(rèn)為中國蜂膠的膠源植物是來自歐洲的黑楊及其雜交品種加拿大楊。

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