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靈芝孢子粉對(duì)鎘致雄性大鼠睪丸雄激素結(jié)合蛋白和抑制素表達(dá)的影響

劉艷榮，葛振丹，金海，黃厚今

(遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察靈芝孢子粉對(duì)鎘致雄性大鼠睪丸雄激素結(jié)合蛋白和抑制素的影響。方法 45只SD雄鼠，隨機(jī)均分為3組：對(duì)照組、Cd組、靈芝孢子粉拮抗組(GLS+Cd)。靈芝孢子粉拮抗組用5mg/kg靈芝孢子粉灌胃，對(duì)照組與Cd組灌胃等量生理鹽水，每天1次。Cd組和GLS+Cd組腹腔注射CdCl22mg/kg，隔天1次。對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。3個(gè)月后分3批處死，間隔為1個(gè)月。用RT-PCR法對(duì)抑制素和雄激素結(jié)合蛋白的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，睪酮定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定血清睪酮濃度。結(jié)果 在鎘染毒1個(gè)月時(shí)，Cd組ABP(雄激素結(jié)合蛋白)表達(dá)量應(yīng)激性升高，在第3個(gè)月Cd組ABP表達(dá)量低于靈芝孢子粉拮抗組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著鎘染毒時(shí)間延長，第2、3個(gè)月Cd組INH-B(抑制素B)表達(dá)量低于靈芝孢子粉+Cd組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；鎘染毒3個(gè)月時(shí)，與對(duì)照組比較，Cd組和靈芝孢子粉拮抗組血清睪酮水平明顯降低(P<0.05)；與Cd組比較，靈芝孢子粉+Cd組血清睪酮水平濃度高(P<0.05)。結(jié)論 靈芝孢子粉可以通過提高ABP、INH-B的表達(dá)對(duì)鎘致雄性大鼠支持細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]鎘；靈芝孢子；雄激素結(jié)合蛋白；抑制素B

鎘(cadmium，Cd)是一種分布廣泛，半衰期長，毒性持久的環(huán)境污染物[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)鎘是新型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemical，EDC)，稱為金屬類激素，具有類雌激素作用[2]。EDC可干擾機(jī)體的內(nèi)分泌產(chǎn)生生殖毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性以及致癌致畸作用等毒性。其中生殖毒性占最高比例，尤其對(duì)雄性生殖毒性系統(tǒng)作用最為突出[3]。眾多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：鎘具有生殖毒性，對(duì)精子、生精細(xì)胞、睪丸、附睪的功能和結(jié)構(gòu)均有影響[4-6]。睪丸的支持細(xì)胞功能和精子形成有密切關(guān)系[7],支持細(xì)胞合成和分泌的抑制素(inhibin，INH)和雄激素結(jié)合蛋白(androgen binding protein，ABP)是其功能標(biāo)志，其中在成年雄性體內(nèi)INH的重要生理形式是INH-B[8]。研究靈芝孢子粉(Ganoderma lucidum spore，GLS)對(duì)鎘致雄性大鼠INH-B和ABP的影響，可為鎘致雄性生殖毒性的預(yù)防和治療和靈芝孢子粉的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器分析純氯化鎘(美國Sigma公司)；靈芝孢子粉(由貴州吉仁堂藥業(yè)有限公司饋贈(zèng))；睪酮定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海巧伊生物科技有限公司)；總RNA試劑盒(lot:20140120)，cDNA合成試劑盒(lot:20140126)，SYBR GREEN熒光定量試劑盒(lot:20140113)，購于華興創(chuàng)新(北京)科技有限公司。通用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；TU1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析儀器有限責(zé)任公司)；iCycler熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD)。

1.2動(dòng)物分組及處理健康雄性SD大鼠45只，體重(152±20)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，合格證號(hào)：SCXK(渝)2007-0005。自由飲食，室溫(23±2)℃，相對(duì)濕度50%～70%，光照每12小時(shí)明暗交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)均分3組，對(duì)照組、單獨(dú)染鎘(Cd)組、靈芝孢子粉拮抗組(GLS+Cd)。靈芝孢子粉拮抗組灌胃5 mg/kg靈芝孢子粉，對(duì)照組與Cd組灌胃等量生理鹽水，每天1次。Cd組和GLS+Cd組腹腔注射CdCl22 mg/kg[9]，隔天1次。對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。3個(gè)月后分3批處死，間隔為1個(gè)月。末次給藥24 h后，10%水合氯醛麻醉，取血、睪丸。

1.3血清睪酮濃度檢測末次給藥24 h后，10%水合氯醛麻醉腹主動(dòng)脈取血3～5 mL，置于清潔的塑料試管中， 4 ℃冰箱靜置24 h，離心(3 000 r/min，5 min)，取血清放置于4 ℃冰箱保存。按照睪酮定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.4RT-PCR法檢測ABP、INH-B的表達(dá)大鼠斷頭處死后取出雙側(cè)睪丸，置于-80℃冰箱中備用。-80℃冰箱中取出睪丸組織50mg，研磨組織，將研磨好的組織加入到冰預(yù)冷1mL細(xì)胞裂解液中，按照試劑盒提取RNA。用紫外分光光度計(jì)測定其純度和含量；用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察RNA的完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)從Genebank查找所得的目的蛋白的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物由北京博樂通生物科技有限公司合成。ABP引物序列：上游5’-CTGGCTTGATTTCCCTTGTG-3’，下游5’-CCCTGTTGCTTGTC TTCCTC-3’,106bp；INH-B引物序列：上游5’-GTGGGCTGAGTGTGGTTGTT-3’，下游5’-CTCCCTCTGGTTCTGACTGG -3’,102bp；內(nèi)參GADPH引物序列：上游5’-TGCAGTGCCAGCCTCGTCTC-3’，下游5’-TGAACTTGCCGTGGGTA-3’，192bp。PCR反應(yīng)條件(SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法)：ABP：94 ℃預(yù)變性3 min，Repeat:1，PCR反應(yīng)94 ℃，15 s，Repeat:35，溶解曲線分析60.0～95.0 ℃，10 s，每2個(gè)周期后增加1 ℃，Repeat:36；INH-B：94 ℃預(yù)變性3 min，Repeat:1，PCR反應(yīng)94 ℃，15 s，Repeat:45，溶解曲線分析55.0～95.0 ℃，10 s，每2個(gè)周期后增加1 ℃，Repeat:41；內(nèi)參GADPH：94 ℃預(yù)變性2 min，Repeat:1，PCR反應(yīng)94 ℃，15 s，Repeat:40，溶解曲線分析60.0～95.0 ℃，10 s，每2個(gè)周期后增加1℃，Repeat:36。分析每個(gè)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過溶解曲線分析產(chǎn)物是否為所擴(kuò)增的特異片斷。

1.5ABP、INH-B定量分析方法利用大鼠睪丸組織中目標(biāo)基因的Ct值，采用2-△△Ct法來進(jìn)行相對(duì)定量，△Ct = Ct average (目的基因) - Ct average (內(nèi)參基因)；△△Ct = △Ct (實(shí)驗(yàn)組) -△Ct(對(duì)照組)。2-△△Ct表示劑量組目的基因相對(duì)對(duì)照表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1對(duì)大鼠睪丸組織ABP表達(dá)水平的影響表1結(jié)果顯示在鎘染毒1個(gè)月后，Cd組ABP表達(dá)量應(yīng)激性升高；染毒3個(gè)月后和Cd組比較，靈芝孢子粉+Cd組ABP表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

組別1個(gè)月2個(gè)月3個(gè)月對(duì)照組1.07±0.481.10±0.501.08±0.50Cd組0.78±0.280.63±0.230.45±0.18靈芝孢子粉+Cd組0.57±0.060.95±0.42b0.64±0.34bF3.0385.3455.638P0.1040.0050.004

b與Cd組比較，P<0.05。

2.2對(duì)大鼠睪丸組織INH-B表達(dá)水平的影響表2結(jié)果顯示在鎘染毒2、3個(gè)月后， Cd組INH-B表達(dá)量低于靈芝孢子粉+Cd組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

組別1個(gè)月2個(gè)月3個(gè)月對(duì)照組1.05±0.381.01±0.251.22±0.83Cd組0.61±0.420.80±0.680.28±0.07a靈芝孢子粉+Cd組0.81±0.731.98±0.04b1.00±0.73abF1.9095.2574.478P0.2100.0140.037

a與對(duì)照組比較，P<0.05；b與Cd組比較，P<0.05。

2.3對(duì)大鼠血清睪酮濃度水平的影響圖1顯示鎘染毒3個(gè)月后，和對(duì)照組比較，Cd組和靈芝孢子粉+Cd組血清睪酮水平明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；和Cd組比較，靈芝孢子粉+Cd組血清睪酮水平濃度高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

*P<0.05各組分別與對(duì)照組比較，** P<0.05靈芝孢子粉+Cd組與Cd組比較。圖1　染毒3個(gè)月各組血清睪酮水平比較

3討論

研究證實(shí)重金屬鎘具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)并可影響雄性生殖系統(tǒng)，且鎘造成生殖系統(tǒng)損傷首先作用于睪丸[10-12]。支持細(xì)胞是睪丸曲細(xì)精管內(nèi)唯一的體細(xì)胞，不僅能對(duì)生精細(xì)胞提供營養(yǎng)支持，還能分泌多種具有內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用的活性物質(zhì)[8,13]，近年來，評(píng)價(jià)支持細(xì)胞的功能也成為生殖學(xué)研究的一個(gè)新亮點(diǎn)。

本文以ABP、INH-B基因表達(dá)和血清睪酮T濃度水平含量來反映鎘染毒對(duì)生殖損傷的影響。在鎘染毒1個(gè)月后，Cd組ABP表達(dá)量有增高趨勢，提示為維持正常生精環(huán)境，ABP基因表達(dá)應(yīng)激性增高。隨著染毒時(shí)間的延長Cd組ABP表達(dá)量逐漸降低；染毒3個(gè)月后，靈芝孢子粉+Cd組ABP表達(dá)量相對(duì)于Cd組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這和以往研究一致[14]。抑制素在男性精子發(fā)生、形成過程起重要作用[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著鎘染毒時(shí)間的延長，第2、3個(gè)月Cd組INH-B表達(dá)量明顯低于靈芝孢子粉+Cd組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。間質(zhì)細(xì)胞分泌的T可促進(jìn)和維持精子發(fā)生成熟，有廣泛的生理作用[16]。本結(jié)果顯示鎘染毒3個(gè)月后，和對(duì)照組比較，Cd組和靈芝孢子粉拮抗組血清睪酮有明顯下降(P<0.05)；靈芝孢子粉拮抗組血清睪酮濃度水平高于Cd組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

靈芝孢子粉是靈芝的生殖細(xì)胞，具有靈芝的全部活性物質(zhì)。除此之外，靈芝孢子內(nèi)含有比靈芝更為豐富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白質(zhì)、酶類、硒元素等特殊成份[17]。具有清除自由基、抗腫瘤、抗炎、保肝、降血清膽固醇、降血糖、抗輻射、增強(qiáng)免疫功能、抗病毒等廣泛藥理作用[18]。其抗氧化的作用效果也早已有報(bào)道[19]，前期本課題組關(guān)于靈芝孢子粉已做了一定的工作，證實(shí)[20]靈芝孢子粉可以提高金屬硫蛋白的含量，提高超氧化物歧化酶SOD的活力，降低丙二醛MDA的含量，有效降低鎘致大鼠睪丸生殖細(xì)胞DNA氧化損傷，靈芝孢子粉的抗氧化作用可能是其拮抗鎘染毒造成支持細(xì)胞損傷的主要機(jī)制。以往關(guān)于中藥拮抗鎘致生殖損傷的報(bào)道有很多[21-22]，靈芝孢子粉作為有名的中藥之一，尚未見類似報(bào)道。本文將為靈芝孢子粉的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

綜上，鎘染毒可以使ABP、INH-B基因表達(dá)水平和血清T濃度水平下降造成睪丸支持細(xì)胞損傷。而靈芝孢子粉可以拮抗引起的損傷，為靈芝孢子粉的臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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[收稿2015-04-23;修回2015-05-18]

(編輯：譚秀榮)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

Protective effect of ganoderma lucidum spore on androgen protein and inhibin expressions by cadmium in rat testis

LiuRanrong,GeZhendan,JinHai,HuangHoujin

(School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate the protective effects of ganoderma lucidum spore (GLS) on androgen protein (ABP) and inhibin (INH) expression by cadmium (Cd) in rat testis.Methods Forty five male SD rats were randomly and equally divided into blank control group, Cd group, GLS+Cd group. 5 mg/kg of GLS was given to GLS anti-cadmium group every day, the control group and Cd group were given with 0.9% normal saline, the cadmium alone group and GLS anti-cadmium group were intraperitoneally injected with CdCl2solution of 2 mg/kg, every other day, for three months. Then the rats were sacrificed after 30,60 and 90 days respectively and their blood and testes were reserved for further tests. The mRNA of androgen protein (ABP)and inhibin-B (INH-B) were measured by RT-PCR, and the quantitative analysis of testosterone (T) was determined by the ELISA method.Results Compared with GLS+Cd group, the increase of ABP in Cd group after 1 months, and the decrease of ABP in Cd group after 3 months were significant (P<0.05). Compared with blank and GLS+Cd group, the INH-B expressions decreased in Cd group with the time (P<0.05) after 2 or 3 months. Meanwhile, the decrease of T in Cd and GLS+Cd group was significant (P<0.05) after 3 months compared with control group, and the decrease of T in Cd group was more significant (P<0.05) after 3 months than that of GLS+Cd group.Conclusion Ganoderma lucidum spore could significantly improve the expressions of ABP and INH-B, so as to achieve the role of protecting Sertolicells in rat testis induced by Cd.

[Key words]cadmium; GLS; androgen protein; inhibin-B

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中圖法分類號(hào)] R285.5A

[文章編號(hào)]1000-2715(2015)03-0244-04

[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳聯(lián)合基金重點(diǎn)科研項(xiàng)目(NO：黔科合J字LKZ[2013]05)。

[通信作者]黃厚今，男，博士后，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：營養(yǎng)毒理學(xué)，E-mail:huanghj6688@163.com。