趙　彤，李　柏

(第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海　200433)

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綜述與專論

二乙基亞硝胺在小鼠誘發(fā)性肝癌模型中的應(yīng)用

趙彤，李柏

(第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海200433)

【摘要】DEN二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)對人體和動物都存在劇毒性，即使是小劑量注射或口服給藥也會造成嚴(yán)重的肝損傷。由于對嚙齒類動物誘導(dǎo)肝臟病變的穩(wěn)定性，DEN常用于觀察嚙齒類動物肝癌形成全過程中形態(tài)學(xué)的改變以檢測其癌前病變。在應(yīng)用DEN后小鼠產(chǎn)生的肝損傷會引起肝硬化和腫瘤，使其成為分析人類肝細(xì)胞癌的發(fā)病機制和過程的理想動物模型。然而，一些研究表明，二乙基亞硝胺的致癌作用可能與動物不同遺傳背景，性別，年齡等其他因素相關(guān)。因此，本文通過對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，以期建立穩(wěn)定，成功率高，死亡率低的DEN模型，并對不同目的的實驗提供參考。

【關(guān)鍵詞】二乙基亞硝胺；誘發(fā)性肝癌；小鼠；模型，動物

肝癌是威脅人類健康的主要原因之一，在腫瘤致死率中排名第二[1]。原發(fā)性肝癌的發(fā)生是一個多病因、多階段的結(jié)果，依次經(jīng)歷肝炎-肝硬化-早期肝癌-進(jìn)展期肝癌-肝癌轉(zhuǎn)移[2]。期間可能涉及各種致病因素[3-4]，如病毒性肝炎，酒精性肝硬化等[5-6]，從初始的病毒感染到臨床檢測出肝癌的平均間隔通常為20至40年[7-8]。嚙齒類動物小鼠模型是廣為應(yīng)用的肝癌動物模型[8-11]。在誘發(fā)性肝癌模型中，DEN[12-13]、二甲基亞硝胺、四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)等物質(zhì)是常用致癌誘導(dǎo)劑[14-15]。其中，DEN是一種歸屬于N-亞硝基的有機物質(zhì)，可穩(wěn)定誘導(dǎo)多種組織腫瘤，如肝臟，肺臟，胃和造血系統(tǒng)[16]。DEN造?？僧a(chǎn)生嚴(yán)重的肝損傷，具有致癌性，突變性和致畸性，最突出的表現(xiàn)是中性粒細(xì)胞浸潤，廣泛的小葉出血性壞死，肝細(xì)胞異常分裂，膽管增生，纖維化，和橋接壞死，并最終導(dǎo)致肝癌。但是有研究顯示亞硝胺對于不同遺傳背景，性別等的小鼠作用不一，給藥時間和劑量的不同也可能影響實驗結(jié)果。因此本文旨在通過總結(jié)既往文獻(xiàn)研究，提出適用于小鼠的DEN使用方案，建立高效的DEN小鼠肝癌模型。

1DEN的作用機制

DEN作為N-亞硝基類物質(zhì)的一種，是遺傳毒性致癌物，通過比較基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在DEN引起的腫瘤模型中的基因表達(dá)，與人類肝癌患者的肝癌組織類似且預(yù)后較差[17]。經(jīng)典的DEN誘癌分為啟動-促進(jìn)-演變?nèi)齻€過程，誘導(dǎo)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)損傷和突變以及肝細(xì)胞死亡。由于其急性肝毒性和致癌性，少量的DEN即可對小鼠產(chǎn)生不可逆的致癌作用。1963年的研究發(fā)現(xiàn)，從服用DEN的大鼠肝臟中提取核酸，發(fā)現(xiàn)其N7原子鳥嘌呤乙基化，這一發(fā)現(xiàn)在解釋DEN誘癌的分子機制研究上是一重大進(jìn)展[18]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)DEN最終在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化為可以導(dǎo)致DNA加合物形成的烷基化代謝物，形成活性中間體，這會導(dǎo)致甲基化大分子的形成。其中最關(guān)鍵的是DNA中N-7甲基鳥嘌呤和O6-甲基鳥嘌呤的形成，改變了遺傳信息，從而形成啟動細(xì)胞，在致癌過程中起到了啟動作用。這一轉(zhuǎn)化過程是通過與細(xì)胞色素P450酶類(包括細(xì)胞色素P4502E1)相關(guān)通路實現(xiàn)的[19]，其主要靶器官是肝臟，在小葉中心肝細(xì)胞活性最高，且這一途徑與人類代謝途徑相似。

DEN模型通常被認(rèn)為是化學(xué)性誘導(dǎo)的肝癌模型，也有證據(jù)表明和炎癥反應(yīng)相關(guān)。DEN造成的肝細(xì)胞損傷激活肝巨噬細(xì)胞枯否細(xì)胞，產(chǎn)生肝有絲分裂原，如白細(xì)胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)，這會刺激殘存的肝細(xì)胞代償性增生[20]。DEN誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生被認(rèn)為是受炎癥信號的影響，肝細(xì)胞IκB激酶β(inhibitor kappa B kinase β，IKKβ)損失，阻止核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)的活化，增加DEN誘發(fā)的細(xì)胞死亡，從而增強致癌效果[21]。DEN也與肝細(xì)胞的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累相關(guān)[22-23]，ROS是細(xì)胞有氧代謝的結(jié)果，正常情況下，細(xì)胞可以保持ROS和抗氧化劑如過氧化氫酶，超氧化物岐化酶和多種過氧化物酶等之間的平衡。受DEN的影響，微環(huán)境破壞，ROS增多，產(chǎn)生緊張狀態(tài)，造成如脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和核酸等大分子的直接損害，可能會導(dǎo)致DNA和其他親核物質(zhì)氧化損傷，這種機制會進(jìn)一步加強DEN誘導(dǎo)的肝癌形成[24]。除干擾ROS和抗氧化劑之間的平衡外[25]，DEN還可通過影響細(xì)胞線粒體代謝，引起氧化應(yīng)激和DNA損傷，從而導(dǎo)致癌變。DEN誘導(dǎo)的肝癌使肝巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增加，且與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞與肝癌的侵襲相關(guān)[26]。

單次使用亞硝胺激活Ha-ras原癌基因的突變，但在后續(xù)給予慢性促進(jìn)劑引發(fā)的肝腫瘤，后續(xù)其基因改變?nèi)Q于促進(jìn)劑的使用，如腫瘤強促進(jìn)劑戊巴比妥鈉會引起Ctnnb1基因的突變，編碼wnt/β-catenin通路，使谷氨酰胺合成酶過表達(dá)，導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激增加，由此產(chǎn)生肝細(xì)胞變性和結(jié)構(gòu)變化。CCl4的使用則會增加內(nèi)毒素水平，模擬更接近于臨床大多數(shù)肝癌發(fā)生過程的微環(huán)境。且在DEN改變遺傳信息，形成啟動細(xì)胞后，如果中斷干預(yù)，可能會導(dǎo)致腫瘤消退，無法形成癌性結(jié)節(jié)，因此在促進(jìn)階段是可逆的[27]。

2影響DEN小鼠肝癌模型的因素

2.1品系

不同品系的小鼠對肝癌的易感性不同[28]，如14個月齡的C3Hf系雄鼠、C3H系雄鼠和C3He雄鼠的發(fā)生率分別為72%、85%和80%，而C57BL/6J小鼠自然肝癌發(fā)病率均較低[29]。在DEN誘發(fā)的肝癌模型中，C3H/HeJ小鼠的肝癌發(fā)生率也較C57BL/6J 小鼠高20～50倍[30]。常見的用于DEN誘發(fā)肝癌模型的小鼠品系有BALB/c、 C57BL/6、ICR等，其中高敏感系小鼠包括C3H 和 CBA。中度敏感系有FVB、 SM/J、 P/J、 CE/J、 LP 和AKR/J，相對不敏感的品系有BALB/c、 C57BL/6、 129和SWR。但在DEN誘發(fā)的模型中，即使是相對不敏感品系的小鼠也會發(fā)生肝腫瘤，只是較敏感品系小鼠，會有2～3個月的延遲。

2.2周齡

年齡對于小鼠對DEN的敏感性也有一定的影響。一次性低劑量DEN致小鼠腫瘤的研究顯示，幼鼠肝臟易發(fā)生癌變，且酶活性(比如DEN脫烷基能力)會隨著小鼠年齡增長，大概在7 d到15 d時達(dá)到一個峰值。后期，代謝功能會隨著年齡的增加而降低，且雌性小鼠比雄性小鼠下降更快，大概在出生后42 d達(dá)到一個平穩(wěn)期。在已有文獻(xiàn)中，低劑量DEN注射的造模方式，大多選擇兩周齡小鼠[31]，也可見文獻(xiàn)選用兩周齡小鼠時，注射低劑量DEN溶液后在小鼠飲用水中加入適量DEN等[32]。在選用4-6周齡小鼠時，大多進(jìn)行多次注射/灌胃DEN或與CCl4等肝毒性藥物合用誘癌[33-34]。

2.3性別

過去幾十年的廣泛數(shù)據(jù)顯示，肝癌的發(fā)生率在人類和嚙齒類動物中均呈性別依賴性，男性患病率顯著較高。研究顯示當(dāng)小鼠多次長期接受DEN干預(yù)，100%雄性小鼠發(fā)生肝癌，只有30%的雌性小鼠發(fā)生肝癌。在雄性小鼠6周齡時行睪丸切除術(shù)或使用促性腺激素化學(xué)阻斷劑，降低了肝臟腫瘤的發(fā)生率、多重性和瘤塊大小，而對雌性小鼠進(jìn)行卵巢切除或補充睪酮則顯著提高肝臟腫瘤的發(fā)生率，這可能是因為雌激素抑制肝癌發(fā)生但是雄激素刺激肝癌發(fā)生，雌性小鼠對DEN誘發(fā)的肝癌具有抵抗性[35]。觀察發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠對其他化學(xué)毒性誘癌物引發(fā)的肝癌一般也不易發(fā)生。且有文獻(xiàn)探討發(fā)現(xiàn)，性別導(dǎo)致DEN誘發(fā)的肝癌發(fā)生率不同主要是因為不同性別在枯否細(xì)胞分泌IL-6上有差異，而IL-6的分泌是由雌激素介導(dǎo)的。因此，在IL-6基因敲除的小鼠中，并沒有性別導(dǎo)致的DEN誘發(fā)的肝癌發(fā)生率的差異。

2.4給藥途徑

給藥方式對于小鼠肝臟腫瘤的形成時間的長短有著不一樣的影響，常見的方式有腹腔注射、灌胃、綜合干預(yù)、飲食飲水添加DEN加部分肝切除等。Rignall等[36]對6周大的C3H/N一次性注射DEN(90 mg/kg)，27周后成瘤，但單純DEN組小鼠成瘤率和瘤體大小均小于注射DEN后給予0.05%戊巴比妥鈉組小鼠。Schneider等[37]對兩周大C57BL/6小鼠一次性注射DEN(25 mg/kg)，24周時出現(xiàn)癌前病變，42周時形成肝癌。Santos NP等[38]對五周大的ICR進(jìn)行濃度為35 mg/kg的DEN腹腔注射，一周一次，連續(xù)八周，在第8周時80%的小鼠出現(xiàn)肝組織學(xué)改變和增生性病變，如肝細(xì)胞壞死凋亡，水腫變性等，第22周后出現(xiàn)結(jié)節(jié)，第29周出現(xiàn)肝細(xì)胞腺瘤。不過在整個實驗過程中都未發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌。Iatropoulos MJ等[34]對8周的C57BL/6小鼠進(jìn)行每周一次50 μmol/kg的DEN灌胃，第一次灌胃后10周成瘤。Aleksic等[39]對6周大小鼠一次性注射(90 mg/kg)DEN并在兩周后喂養(yǎng)含0.05%～0.07%苯巴比妥的飼料，32周時誘癌成功。Unterberger EB等在實驗中進(jìn)行了與Aleksic相同的誘癌方式，在第28周時開始出現(xiàn)肝細(xì)胞癌。Thuy le TT等[40]對4周C57BL/6小鼠飲水中喂予含0.05 mg/L(低劑量)或25 mg/L(高劑量)DEN溶液的無菌蒸餾水，高劑量組小鼠在第25周處死，低劑量組小鼠在第36周處死，高劑量組的肝細(xì)胞癌發(fā)生率為44%，低劑量組小鼠肝組織并未發(fā)現(xiàn)瘤塊。劉勇[41]對20 g的C57BL/6 雌性小鼠進(jìn)行300mg/kg的DEN注射,一周后再連續(xù)給3 d二乙?；?2-Acetylfluorene，2-AAF)20mg/kg，然后將小鼠肝臟左葉從根部結(jié)扎并切除(34%肝臟切除)，再連續(xù)3 d用2-AAF灌胃，3周后處死小鼠存活率達(dá)到64.7%，腫瘤標(biāo)志物以及原癌基因表達(dá)顯著升高。

3使用注意

因二甲基亞硝胺對眼睛、皮膚的刺激作用，攝入、吸入或經(jīng)皮膚吸收可能致死，接觸可引起肝、腎損害，實驗人員也應(yīng)做好相應(yīng)保護措施。含DEN的注射溶液的配置過程通常應(yīng)在通風(fēng)櫥里進(jìn)行，操作者需要戴兩層密封的丁晴橡膠手套，防護服，呼吸防護(P3型口罩)和防護眼鏡，且房間內(nèi)應(yīng)標(biāo)記以限制人員入內(nèi)。丁晴手套和注射器在使用后應(yīng)當(dāng)丟棄到危險廢物容器。也有實驗步驟[42]指出超額量的N-亞硝基化合物可以用添加了鎳鋁合金的堿性溶液來銷毀。此外，實驗動物的排泄物應(yīng)當(dāng)每天或每周作為危險垃圾處理。實驗動物應(yīng)與其他動物分開飼養(yǎng)。若出現(xiàn)意外情況下暴露，包括皮膚接觸，吸入或針刺傷，都應(yīng)采集操作人員3 mL尿液樣本并儲藏在-70℃的環(huán)境中用以監(jiān)測亞硝胺代謝產(chǎn)物的情況。這可以對DEN的攝入量有大概的估計，并有助于進(jìn)行危險分析。

4檢測指標(biāo)

DEN誘癌的發(fā)生，經(jīng)過肝炎階段、肝硬化階段、癌前病變、癌變等病變過程，在應(yīng)用DEN的過程中，組織學(xué)改變的特點是廣泛中性粒細(xì)胞浸潤，水樣變性，增生，肝小葉中心廣泛出血性壞死，膽管增生，纖維化，細(xì)胞核大小不均，雙核細(xì)胞，假核仁，細(xì)胞凋亡，肝局灶性壞死和有絲分裂。此外，磁共振成像可使小鼠不受損傷的進(jìn)行肝臟腫瘤發(fā)生發(fā)展的檢測。肝癌前病變與正常肝組織在許多分子表達(dá)上不同，但并沒有明確指南指出哪一指標(biāo)最為敏感，常見指標(biāo)包括藥毒性代謝(細(xì)胞色素P450，環(huán)氧化物水解酶，G-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶胎盤形成)，能量代謝(葡萄糖-6-磷酸酶，糖原磷酸化酶)，溶酶體活性(β-葡萄糖醛酸酶)，細(xì)胞間交換(間隙連接蛋白34)鐵代謝，以及細(xì)胞循環(huán)(細(xì)胞周期蛋白D，細(xì)胞周期蛋白E)等。

5結(jié)語和展望

DEN作為小鼠肝癌模型的經(jīng)典誘癌藥物，成功率高，靶向性好，操作方便，但是其造模時間長，小鼠的品系、小鼠的性別、用藥的劑量和方式等都對模型的建立有所影響，且目前無統(tǒng)一的造模方式。在已有實驗數(shù)據(jù)中，采用高敏感系雄性小鼠，并采取綜合干預(yù)，小鼠肝細(xì)胞癌成癌率高，死亡率低，操作方便，是較為理想的造模方式。

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〔修回日期〕2015-12-25

[基金項目]國家自然科學(xué)基金項目(81503632)。

[作者簡介]趙彤(1989-)，女，碩士生，專業(yè)：中西醫(yī)結(jié)合。E-mail: zhaotong1024@ foxmail. com [通訊作者]李柏(1964-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治肝癌。E-mail: libai9@l26.com

【中圖分類號】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 01-0076-05

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.015

Application of diethylnitrosamine in induced-liver cancer mouse model

ZHAO Tong，LI Bai

(Department of TCM,Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

【Abstract】Diethylnitrosamine (DEN) is highly toxic to both human and animals, even the parenteral or oral administration of the smallest quantities results in severe liver damage. Due to the robustness of the induced hepatic alterations, the application of DEN in rodents has become an attractive experimental model for studies aimed at understanding the pathogenetic alterations underlying the formation of liver cancer. The liver injury induced by DEN in mice can cause liver cirrhosis and tumors, which makes it an ideal animal model to analyze the pathogenesis and process of human hepatocellular carcinoma. However, some studies have indicated that the carcinogenic effect of Diethylnitrosamine may be related to the different genetic background, gender, age and other factors. Therefore, this article reviews the relevant literatures, in order to establish a stable, high success rate, low mortality DEN model, and to provide references for different purposes.

【Key words】Diethylnitrosamine；Induced liver cancer；Mice；Model,animal